Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu bằng chỉ thị phân tử RAPD

Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu bằng chỉ thị RAPD đã được thực hiện từ tháng 3/2018 đến tháng 10/2018.

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN CÂY MÃNG CẦU TA TẠI TỈNH BÀ RỊA - VŨNG TÀU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD Đỗ Văn Thịnh1, Phạm Thị Mười1, Trương Quốc Ánh2, Bùi Anh Xuân2, Nguyễn Đắc Thành2, Lương Thế Minh2, Chung Anh Dũng2, Mai Văn Trị1 TÓM TẮT Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen mãng cầu ta tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu thị RAPD thực từ tháng 3/2018 đến tháng 10/2018 Mẫu 40 cá thể mãng cầu ta qua tuyển chọn thu thập để ly trích DNA, sản phẩm DNA khuếch đại 10 thị RAPD Kết cho thấy, dựa vào sơ đồ quan hệ di truyền chia 40 cá thể thu thập thành nhóm với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,76 đến Trong đó, nhóm I gồm 39 cá thể, nhóm II gồm cá thể Kết nghiên cứu cho thấy mức độ đa dạng di truyền 40 cá thể thu thập, đồng thời cho thấy khác biệt nhóm mãng cầu địa phương mãng cầu ta du nhập mà khai thác cho chương trình chọn tạo giống Từ khóa: Mãng cầu ta, đa dạng di truyền, RAPD, Bà Rịa - Vũng Tàu I ĐẶT VẤN ĐỀ II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mãng cầu ta (Annona squamosa L.) gọi na ăn trồng rộng rãi nước ta Bà Rịa - Vũng Tàu tỉnh trồng nhiều mãng cầu ta Lồi ăn dễ trồng, có giá trị kinh tế cao, có tiềm xuất mang lại thu nhập tốt cho người trồng Qua điều tra cho thấy, giống sản xuất đại trà có nhược điểm nhỏ nhiều hạt Do việc nghiên cứu chọn tạo giống để cải thiện tính trạng cần thiết Ngày nay, với phát triển kỹ thuật sinh học phân tử, nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền sử dụng thị DNA ứng dụng rộng rãi nghiên cứu chọn lọc giống trồng (Nguyễn Đức Thành, 2014) Trên giới, nhiều nghiên cứu ứng dụng thị phân tử RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) phân tích đa dạng di truyền chi na (Annona) thực hiện, có mãng cầu ta (Ronning et al., 1995, Bharad et al., 2009; Ahmad et al., 2010; Guimarães et al., 2013; Anugari et al., 2016) Ở Việt Nam, thị phân tử RAPD ứng dụng để đánh giá đa dạng di truyền số trồng chưa thực mãng cầu ta Gần đây, nguồn gen mãng cầu ta tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu (BRVT) khảo sát với 40 cá thể quần thể mãng cầu ta sản xuất có khác biệt hình thái thu thập bảo tồn (Nguyễn Tuấn Vũ ctv., 2018) Nghiên cứu tiến hành để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen mãng cầu ta tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu mà đại diện 40 cá thể thu thập nêu thị phân tử RAPD 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu gồm 40 cá thể mãng cầu ta tuyển chọn thu thập từ nghiên cứu trước Nguyễn Tuấn Vũ cộng tác viên (2018) tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu (Bảng 1) Các mãng cầu ta sử dụng làm mẫu kí hiệu từ BRVT01 đến BRVT40 2.2 Phương pháp nghiên cứu Ly trích kiểm tra DNA: DNA mẫu mãng cầu ta ly trích theo phương pháp CTAB (Doyle and Doyle, 1990) Sau ly trích, DNA kiểm tra cách điện di gel agarose 2% (w/v), mẫu có vạch DNA rõ nét, khơng bị đứt gãy, có độ tinh cao sử dụng cho phản ứng PCR Phản ứng khuếch đại DNA với 10 đoạn mồi RAPD (Bảng 2), sản phẩm PCR sử dụng để chạy điện di gel agarose 2%, nhuộm gel ethidium bromide chụp gel tia UV, kết sử dụng để xây dựng phân nhánh di truyền phần mềm NTSYSpc 2.11a theo phương pháp UPGMA (Sneath and Sokal, 1973) Phân tích sơ đồ hình nhánh đánh giá mối quan hệ di truyền mãng cầu ta dựa ma trận hệ số tương đồng (Nei and Li, 1979) Giá trị PIC (Polymorphic information content) sử dụng để đánh giá hiệu mồi việc phân biệt kiểu gen đặc trưng Giá trị PIC xác định theo công thức: PIC = – Σ(Pi2); Trong đó: Pi tần số alen i kiểu gene kiểm tra, phạm vi giá trị PIC từ (khơng đa hình) tới (đa hình hồn tồn) Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn miền Đông Nam bộ, Viện Cây ăn miền Nam Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam 22 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Bảng Danh sách địa điểm thu thập 40 mẫu mãng cầu ta tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu Mẫu 1-3 4-6 7-8 - 10 11 - 13 14 - 17, 29 - 30 18 19 - 21 22 - 24 25 - 28 31, 36 - 40 32** 33** 34 - 35 Tên chủ vườn địa điểm thu thập Trần Văn Thêm (Ấp Phước Thới, xã Phước Long Thọ, huyện Đất Đỏ) Lê Văn Tùy (Khu phố Phước Sơn, T.T Đất Đỏ, huyện Đất Đỏ) Huỳnh Văn Tú (Ấp Phước Thới, xã Phước Long Thọ, huyện Đất Đỏ) Nguyễn Văn Hùng (Ấp Phước Thới, xã Phước Long Thọ, huyện Đất Đỏ) Phạm Tuấn Ngọc (Khu phố Thanh Long, TT Đất Đỏ, huyện Đất Đỏ) Tọa độ* [N10029’52,6” E107017’10,5”] ± 10 m [N10030’19,8” E107017’4,0”] ± 11 m [N10030’50” E107017’12,4”] ± 15 m [N10031’03” E107017’23”] ± m [N10030’51,9” E107016’25,8”] ± 21 m [N10032’15,8” E107017’48,3”] ± 12 m Võ Văn Siêng (Ấp Tân Hòa, xã Long Tân, huyện Đất Đỏ) Nguyễn Văn Nguyện (Khu phố Thanh Long, TT Đất Đỏ, huyện Đất Đỏ) Lý Hùng Cường (Ấp Tân Hòa, xã Long Tân, huyện Đất Đỏ) Phạm Hữu (Ấp Cây Cám, xã Láng Dài, huyện Đất Đỏ) Đỗ Sung (Ấp Cây Cám, xã Láng Dài, huyện Đất Đỏ) [N10031’16,8” E107016’31,5”] ± 18 m [N10032’21” E107017’43,2”] ± m [N10030’53,7” E107020’40,1”] ± m [N10031’19,3” E107020’40,1”] ± m Đào Văn Hiếu (Ấp Phú Lâm, xã Hòa Hiệp, huyện Xuyên Mộc) [N10040’21,0” E107032’12,0”] ± 59 m Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn miền Đông Nam Bộ (Khu phố Nông Trường, phường Hắc Dịch, Tx Phú Mỹ) Đặng Văn Phức (Ấp 2, xã Tóc Tiên, Tx Phú Mỹ) Nguyễn Tiến Hồng (Ấp 2, xã Tóc Tiên, Tx Phú Mỹ) [N10038’5,0” E10708’27”] ± 11 m [N10037’24,9” E10705’35,2”] ± m [N10035’49,4” E10707’0,2”] ± 10 m Ghi chú: *: Tọa độ vị trí thu thập xác định App GPS Map + Window phone; **: giống du nhập Bảng Danh sách 10 đoạn mồi RAPD sử dụng phản ứng PCR STT Tên mồi OPA02 OPA11 OPB01 OPB05 OPB07 Trình tự (5’-3’) TGCCGAGCTG CAATCGCCGT GTTTCGCTCC TGCGCCCTTC GGTGACGCAG 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm thực từ tháng 3/2018 đến tháng 10/2018 phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn miền Đơng Nam phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết ly trích DNA cho thấy tất 40 mẫu DNA có độ tinh cao đủ điều kiện cho phản ứng PCR Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% 40 mẫu mãng cầu ta với 10 đoạn mồi RAPD cho thấy có tổng số 2308 alen khuếch đại với đa hình cao, số alen trung bình thị RAPD 230,8 Chỉ thị OPA02 khuếch đại STT 10 Tên mồi OPB08 OPB10 OPB12 OPB15 OPB17 Trình tự (5’-3’) GTCCACACGG CTGCTGGGAC CCTTGACGCA GGAGGGTGTT AGGGAACGAG số alen cao 291 alen thị OPB10 cho số alen 136 Số alen mẫu qua 10 thị RAPD có khác đáng kể (Bảng 3) Tính đa hình thị RAPD cịn đánh giá thơng qua giá trị lượng thơng tin đa hình (PIC) Giá trị PIC thị phụ thuộc vào số lượng alen phát vị trí locus tần số alen Giá trị PIC lớn lượng thơng tin đa hình mà thị cung cấp nhiều ngược lại Trong tổng số 40 mẫu mãng cầu ta thực phản ứng PCR với 10 thị RAPD cho thấy giá trị PIC biến thiên từ 0,727 - 0,982, cao thị OPA11 thấp thị OPB07, giá trị PIC trung bình 0,838 (Bảng 3) 23 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Bảng Sự đa hình 10 đoạn mồi RAPD 40 mẫu mãng cầu ta tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu thông qua số alen giá trị PIC STT 10 Mồi OPA02 OPA11 OPB01 OPB05 OPB07 OPB08 OPB10 OPB12 OPB15 OPB17 Trung bình Số alen 291 185 280 290 226 239 136 280 228 153 230,8 PIC 0,874 0,982 0,835 0,878 0,727 0,833 0,841 0,799 0,749 0,860 0,838 Mối quan hệ di truyền 40 cá thể mãng cầu ta nghiên cứu thể thông qua hệ số tương đồng di truyền sơ đồ quan hệ di truyền Hình Kết cho thấy hệ số tương đồng di truyền 40 cá thể mãng cầu ta nghiên cứu dao động từ 0,76 đến thành nhóm sau: Nhóm I có mối quan hệ gần mặt di truyền với hệ số tương đồng dao động từ 0,85 đến chia nhóm thành nhóm phụ gồm nhóm I.1 có 37 cá thể BRVT01, BRVT02, BRVT03, BRVT04, BRVT05, BRVT06, BRVT07, BRVT08, BRVT09, BRVT40, BRVT10, BRVT39, BRVT11, BRVT34, BRVT35, BRVT36, BRVT37, BRVT38, BRVT22, BRVT24, BRVT23, BRVT25, BRVT26, BRVT27, BRVT28, BRVT12, BRVT17, BRVT18, BRVT13, BRVT14, BRVT15, BRVT16, BRVT29, BRVT19, BRVT20, BRVT21 BRVT33 Trong nhóm cá thể BRVT03, BRVT04, BRVT05, BRVT06 BRVT07 có quan hệ chặt mặt di truyền với hệ số tương đồng di truyền 1; Tương tự cá thể BRVT08, BRVT09 BRVT34, BRVT35 có mối quan di truyền chặt (hệ số tương đồng 1) Nguyên nhân nhân từ nguồn gốc nên có di truyền hồn tồn giống Nhóm I.2 có cá thể BRVT30 BRVT31, hai cá thể có mối quan hệ gần mặt di truyền với hệ số tương đồng đạt 0,91 Nhóm II gồm cá thể BRVT32 có mối quan hệ di truyền với nhóm I mức hệ số tương đồng di truyền 0,76 Do đó, thị RAPD với 10 đoạn mồi Bảng phân nhóm cá thể có nguồn gốc địa phương (nhóm I) cá thể du nhập (nhóm II) phản ánh đa dạng di truyền cá thể địa phương Ngoài ra, BRVT32 BRVT33 hai cá thể du nhập, nhiên từ kết phân tích đa dạng di truyền trình bày hình hai cá thể lại thuộc hai nhóm khác nhau, nguyên nhân hai cá thể nhân giống từ hai nguồn có di truyền khác xa Bên cạnh đó, cá thể BRVT33 lại thuộc nhóm I (nhóm có nguồn gốc địa phương), nguồn gốc cá thể có di truyền tương tự với di truyền cá thể địa phương thuộc nhóm I cá thể BRVT33 tách thành nhánh riêng với hệ số tương đồng di truyền đạt 0,86 so với cá thể mãng cầu ta địa phương Hình Kết phân nhóm di truyền 40 cá thể mãng cầu ta dựa hệ số tương đồng di truyền (coefficient) 10 đoạn mồi RAPD 24 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen mãng cầu dựa vào thị phân tử RAPD nhiều nghiên cứu sử dụng Bharad cộng tác viên (2009), sử dụng 26 thị phân tử RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 11 mẫu thuộc chi Annona gồm AKCa01, AKCa02, AKCa03, AKCa04, AKCa05, AKCa06, AKCa07, AKCa08, AKCa09, AKCa10 Balanagar thu thập Ấn Độ, kết có 19 thị phân tử RAPD đa hình mẫu AKCa05, AKCa07 AKCa10 hoàn toàn khác kiểu gen, kiểu gen lại tương tự Kết nghiên cứu Ahmad cộng tác viên (2010), cho thấy tổng số 20 thị RAPD sử dụng có 14 thị khuếch đại DNA với 48 băng, có 25 băng đa hình (52%) tổng số 17 kiểu gen thu thập chia thành nhóm với mức độ di truyền khác Tương tự, từ 20 kiểu gen thu thập thuộc chi Annona, Anugari cộng tác viên (2016), sử dụng 11 thị RAPD sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền cho kết có 152 băng khuếch đại (80,01% đa hình), hệ số tương đồng di truyền từ 0,44 đến 0,92 phân thành nhóm, giá trị PIC biến động từ 0,86 đến 0,92 Như vậy, kết phân tích đa dạng di truyền 40 cá thể mãng cầu ta nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Bharad cộng tác viên (2009), Ahmad cộng tác viên (2010), Anugari cộng tác viên (2016) IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Kết nghiên cứu thể mức độ đa dạng di truyền 40 cá thể thu thập tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,76 - phân thành hai nhóm chính, đồng thời cho thấy khác biệt nhóm mãng cầu địa phương mãng cầu ta du nhập Dù khác biệt khơng lớn ứng dụng khác biệt chương trình chọn tạo giống 4.2 Đề nghị Ứng dụng kết nghiên cứu làm sở cho chương trình chọn tạo giống mãng cầu theo mục đích khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Đức Thành, 2014 Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật Tạp chí Sinh học, 36(3): 265-294 Nguyễn Tuấn Vũ, Lê Thị Huyền, Phạm Thị Mười, Đỗ Văn Thịnh, Huỳnh Kỳ Mai Văn Trị, 2018 Kết điều tra, thu thập bảo tồn nguồn gen mãng cầu ta tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 4(89): 92-98 Ahmad I., S Bhagat, T.V.R.S Sharma, K Kumar, P Simachalam and R.C Srivastava, 2010 ISSR and RAPD marker based DNA fingerprinting and diversity assessment of Annona spp in South Andamans Indian Journal of Horticulture, (67): 147-151 Anugari, H., H.L Dhaduk, S Kumar, J.J Dhruve, M.J Parekh and A.A Sakure, 2016 Molecular diversity of Annona species and proximate fruit composition of selected genotypes Biotech., (6): 204-214 Bharad S.G., P.L Kulwal and S.A Bagal, 2009 Genetic diversity study in Annona squamosa by morphological, biochemical and RAPD markers Acta Hort., (839): 615-623 Doyle J.J and J.L Doyle, 1990 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf material Phytochemical Bulletin, (19): 11-15 Guimarães J.F.R., S Nietsche, M.R Costa, G.B.R Moreira, M.C.T Pereira and W Vendrame, 2013 Genetic diversity in sugar apple (Annona squamosa L.) by using RAPD markers Revista Ceres, 60(3): 428-431 Nei M and W.H Li, 1979 Mathematical models for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases Proc Natl Acad Sci USA, (76): 5269-5273 Ronning C.M., R.J Schnell and S Gazit, 1995 Using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers to identify Annona cultivars J Amer Soc Hort Sci., 120(5): 726-729 Sneath P.H and R.R Sokal, 1973 Numerical taxonomy - The principles and practice of numerical classification W.H Freeman and Company, San Francisco, USA Evaluation of genetic diversity of sugar apple in Ba Ria - Vung Tau province by RAPD markers Do Van Thinh, Pham Thi Muoi, Truong Quoc Anh, Bui Thi Xuan, Nguyen Dac Thanh, Luong The Minh, Chung Anh Dung, Mai Van Tri Abstract Study on the genetic diversity of sugar apple in Ba Ria - Vung Tau province was carried out from March - October, 2018 by using RAPD markers Leaf samples of 40 selected sugar apple genotypes were collected for DNA extraction and DNA extracts were amplified by 10 RAPD primers The results showed that these selected sugar apple genotypes were divided into two main groups with the genetic similarity coefficient from 0.76 to The first group consisted of 25 ... Nam - Số 1(98)/2019 Bảng Danh sách địa điểm thu thập 40 mẫu mãng cầu ta tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu Mẫu 1-3 4-6 7-8 - 10 11 - 13 14 - 17, 29 - 30 18 19 - 21 22 - 24 25 - 28 31, 36 - 40 32** 33** 34 -. .. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen mãng cầu dựa vào thị phân tử RAPD nhiều nghiên cứu sử dụng Bharad cộng tác viên (2009), sử dụng 26 thị phân tử RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 11 mẫu thuộc... mức độ đa dạng di truyền 40 cá thể thu thập tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,76 - phân thành hai nhóm chính, đồng thời cho thấy khác biệt nhóm mãng cầu địa