Bài viết Đa dạng di truyền loài Mỡ ba vì (Manglietia conifera Dandy) tại Vườn Quốc gia Ba Vì dựa trên chỉ thị phân tử RAPD được nghiên cứu nhằm góp phần quan trọng trong lĩnh vực bảo tồn và sử dụng nguồn gen hiệu quả bởi những giá trị kinh tế mà loài cây này mang lại.
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2022.0008 ĐA DẠNG DI TRUYỀN LỒI MỠ BA VÌ (Manglietia conifera Dandy) TẠI VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD Vũ Quang Nam1, , Cao Thị Việt Nga1, Nguyễn Thiện Đạt1, Nguyễn Gia Hồng Đức1 Tóm tắt 25 mẫu Mỡ ba (Manglietia conifera Dandy) bánh tẻ thu ngẫu nhiên khu vực khác từ cốt 1000 m đến đỉnh 1.296 m đánh giá tính đa dạng di truyền với 11 mồi RAPD (CP4, CP7, CP8, CP15, CP17, OPB11, OPB18, OPE14, OPG13, RM1 RM5) Kết cho thấy tổng số 652 băng, có 57 băng đa hình Số phân đoạn ADN nhân dao động từ đến mồi khác Các mẫu Mỡ ba có hệ số tương đồng di truyền cặp nằm khoảng 0,46 đến 0,9 trung bình 0,62; chứng tỏ mức độ tương đồng di truyền mẫu Mỡ ba Vườn Quốc gia Ba Vì khơng cao, có khả cao tạo ưu lai sinh sản hữu tính để tạo nên đa dạng di truyền tập đoàn mẫu nghiên cứu Trên sơ đồ hình 25 mẫu Mỡ ba sử dụng 11 mồi RAPD chia làm nhóm chính, nhóm A gồm mẫu M11 M13; nhóm B: bao gồm 23 mẫu chia thành nhóm nhỏ B1 (gồm 14 mẫu: M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M14, M15, M17) B2 (gồm mẫu: M16, M18, M19, M20, M21, M22, M23, M24, M25) Nghiên cứu cho thấy ưu đa dạng nguồn gen di truyền cá thể Mỡ ba quần thể lồi Vườn Quốc gia Ba Vì Từ khóa: Đa dạng di truyền, Magnoliaceae, Manglietia conifera, RAPD, Vườn Quốc gia Ba Vì ĐẶT VẤN ĐỀ Mỡ ba (Manglietia conifera Dandy), thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), lồi gỗ, có chiều cao tới 30 m, đường kính cỡ 30 cm Đặc điểm hình thái bật dễ nhận biết loài thể chỗ chồi búp cành non phủ lông nâu đỏ; vết sẹo kèm dài 1/3-1/2 cuống lá; phiến dạng trứng ngược tới xoan, dày, dai, phủ lông mặt lúc non; cuống hoa có đốt, dài cách đặc biệt (2,5-5,5 cm), rủ xuống; hoa đơn độc, mọc đầu cành, cánh hoa màu trắng kem, nhị màu đỏ tươi; đại, gần trịn, đài mở sống lưng (Hình 1) Lồi Manglietia conifera thường bị nhầm lẫn với loài M phuthoensis Dandy (nhị màu trắng, cuống hoa ngắn, hai đốt, dài, chồi búp cành non không lông, sẹo kèm ngắn) (Vu cộng sự., 2019) Gỗ Mỡ ba mềm nhẹ Tỷ trọng độ ẩm 15 % 0,48, dăm mịn, thịt đều, co rút, bị mối mọt (Đào Xuân Thu, 2011) Vì vậy, lồi ưa chuộng dùng làm thủ cơng mỹ nghệ đóng đồ gia dụng Mỡ ba có phân bố rộng khắp từ Bắc vào Nam, số lượng cá thể trưởng thành ít, quần thể chia cắt (Vu, 2011) Đã có số cơng trình nghiên cứu Mỡ ba Việt Nam, nhiên nghiên cứu di truyền phân tử lồi cịn hạn chế Bài viết kết nghiên cứu đa dạng di truyền Mỡ ba thị RAPD - kỹ thuật cho phép phát nhanh tính đa dạng di truyền lồi/quần thể Phương pháp đơn giản, khơng địi hỏi kỹ thuật cao, khơng phải sử dụng đồng vị phóng xạ, phát Trường Đại học Lâm nghiệp Email: namvq@vnuf.edu.vn; namvq1975@gmail.com 70 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM nhiều locus lúc, nên sử dụng rộng rãi việc đánh giá đa dạng di truyền ngày Các mẫu vật lồi Mỡ ba thu từ Vườn Quốc gia Ba Vì - nơi phát cơng bố lồi (Dandy, 1930) Kết nghiên cứu góp phần quan trọng lĩnh vực bảo tồn sử dụng nguồn gen hiệu giá trị kinh tế mà loài mang lại VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 25 mẫu bánh tẻ loài Manglietia conifera lấy 03 khu vực khác quần thể khu vực Vườn Quốc gia Ba Vì, từ cốt 1.000 m đến đỉnh 1.296 m Các cá thể có chiều cao vút (Hvn) từ 10-20 m, có đường kính ngang ngực (D1,3) từ 20-35 cm Các mẫu ký hiệu từ M1 đến M25 Hình Mỡ ba (Manglietia conifera) A Búp hoa với cuống dài, đốt; B Các cánh hoa, nhị, nhuỵ cuống hoa dài, đốt; C Cành mang chưa chín Ảnh: Vũ Quang Nam 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN ADN tổng số tách chiết phương pháp CTAB theo Doyle & Doyle (1990) có cải tiến theo điều kiện phịng thí nghiệm Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp 2.2.2 Phương pháp PCR Phản ứng PCR với mồi RAPD thực máy System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ) với tổng thể tích 15 µl/phản ứng gồm thành phần sau: Nước khử ion vơ trùng (5,3 µl), x PCR Master mix Solution (7,5 µl), mồi RAPD (1,2 µl), ADN (1µl) ADN pha loãng với H2O deion với nồng độ pha loãng gấp 20 lần Các thành phần hỗn hợp trộn đưa vào máy PCR theo chương trình cài sẵn với 40 chu kỳ, gồm bước: 94 0C phút; 94 0C 45 giây; 38 0C 45 giây; 72 0C phút; 72 0C phút Lặp lại 40 chu kỳ từ bước đến bước 4; Giữ nhiệt độ oC Trong nghiên cứu sử dụng 11 mồi thể Bảng PHẦN NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 71 2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu RAPD Kiểm tra ADN tổng số sản phẩm PCR phương pháp điện di gel agarose 0,8 % (đối với ADN tổng số) agarose 1,5 % (đối với sản phẩm PCR), sử dụng đệm TAE 1X, nhuộm gel RedsafeTM Nucleic Acid gel Stain, thực thiết bị điện di hãng Bio-Rad (Mỹ) Sản phẩm PCR nhuộm chụp ảnh để phân tích Xác định băng đơn hình đa hình dựa vào xuất khơng xuất băng mẫu nghiên cứu Nếu phân đoạn ADN (có kích thước cụ thể dựa ADN thang chuẩn (ADN marker) xuất mẫu i không xuất mẫu j xuất đồng thời 02 mẫu i j khơng xuất mẫu khác phân đoạn ADN phân đoạn đa hình Ngược lại, phân đoạn ADN xuất tất mẫu nghiên cứu gọi phân đoạn đơn hình Các đoạn mã hóa số tự nhiên 1, mẫu xuất đoạn ADN ký hiệu 1, cịn khơng xuất ký hiệu Các số liệu nhị phân đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.11X (Rohlf, 2000) để tính ma trận tương đồng (Similarity matrix) ma trận khoảng cách (Distance matrix) cặp mẫu (Nei Li, 1979) Dij = 2nij/(ni+nj) Trong đó, nij số băng chung hai cá thể, ni nj số băng cá thể i j, Dij hệ số tương đồng di truyền cá thể i j Bảng Trình tự cặp mồi RAPD sử dụng nghiên cứu Stt 10 11 Tên mồi CP4 CP7 CP8 CP15 CP17 OPB11 OPB18 OPE14 OPG13 RM1 RM5 Trình tự (5’-3’) 5’CTGGGCACGA3’ 5’TTCCGCCACC3’ 5’CCGCTACCGA3’ 5’CCTTTCCCTC3’ 5’CTGCTGGGAC3’ 5’CCACAGCAGT3’ 5’CAATCGCCGT3’ 5’GTCCACACGG3’ 5’CCAGACCCTG3’ 5’TGCGGC TGAG3’ 5’AACGGTGACC3’ Nhiệt độ gắn mồi (oC) 38 oC 37 oC 38 oC 38 oC 37 oC 35 oC 33 oC 38 oC 37 oC 37 oC 32 oC KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết tách chiết ADN tổng số mẫu Manglietia conifera Hình Hình cho thấy ADN mẫu nghiên cứu tách chiết thành công với băng vạch thu gọn tương đối rõ nét, không xuất băng phụ, không bị đứt gẫy Kết đo OD cho số OD260/OD280 mẫu nằm khoảng 1,8 đến 2,0 Do vậy, ADN tổng số thu có độ nguyên vẹn cao, hoàn toàn đáp ứng điều kiện thực phản ứng PCR-RAPD ADN pha loãng để sử dụng cho phản ứng PCR-RAPD với nồng độ sau pha lỗng 20 ng/µl 72 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Hình Ảnh điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số 25 mẫu Mỡ ba Ghi chú: Giếng 1-25 tương ứng với 25 mẫu M conifera nghiên cứu (M1-M25) 3.1 Kết phân tích đa dạng di truyền Hiệu sử dụng mồi RAPD phân tích đa dạng di truyền mẫu Mỡ nghiên cứu: Tiến hành phản ứng PCR với 11 mồi RAPD Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose cho thấy phân đoạn ADN thu có đa hình cao (Hình 3) Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi RAPD 25 mẫu M conifera Mồi CP4 (ảnh bên trái), Mồi OPB18 (ảnh bên phải); M: marker – thang ADN chuẩn kb; Giếng 1–25: 25 mẫu Mỡ ba (M1-M25) Phân tích ảnh điện di qua việc nhị phân hóa xuất phân đoạn ADN xử lý thống kê tổng hợp đánh giá Bảng Bảng cho thấy tất 11 mồi mẫu nhiên sử dụng nghiên cứu cho kết khuếch đại băng ADN tất mẫu, thu tổng cộng 652 băng, có 627 băng đa hình, chiếm 96,2 % Trung bình mẫu cho 26 băng mồi cho 59 băng Số phân đoạn ADN nhân 58, 57 phân đoạn phân đoạn đa PHẦN NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 73 hình chiếm tỉ lệ 98,3 % Mồi CP7 RM1 có số loại phân đoạn ADN khuếch đại nhiều (8 phân đoạn), đó, mồi lại xuất từ đến phân đoạn ADN khuếch đại Đặc biệt có mồi OPE14 xuất phân đoạn có phân đoạn đơn hình, mồi OPE14 mồi có phân đoạn ADN đơn hình Tất 11 mồi cho tỷ lệ phân đoạn ADN đa hình 98,3 % (CP4, CP7, CP8, CP15, CP17, OPB11, OPB18, OPG13, RM1, RM5) mồi OPE14 có băng đơn hình Số phân đoạn ADN trung bình/mẫu có khác biệt lớn dao động khoảng từ 0,44 (OPB11) đến 4,2 (RM1) Tỷ lệ phân đoạn đa hình cao (98,3 %) số phân đoạn ADN trung bình/mẫu dao động lớn cho thấy mức độ đa dạng di truyền mẫu Mỡ ba nghiên cứu cao Bảng Số phân đoạn băng đa hình 11 mồi RAPD phân tích mẫu M conifera Stt Tên mồi 10 11 Tổng CP4 CP7 CP8 CP15 CP17 OPB11 OPB18 OPE14 OPG13 RM1 RM5 Số phân đoạn nhân 6 58 Số băng đa hình Số lượng Tỉ lệ (%) Tổng số băng/mồi 6 4 57 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 73% 100% 100% 100% 96,2% 69 75 43 44 61 11 67 92 17 105 68 652 Số băng trung bình/mẫu 2,76 3,00 1,72 1,76 2,44 0,44 2,68 3,68 0,68 4,20 2,72 3.2 Mối quan hệ di truyền đa dạng di truyền 25 mẫu M conifera nghiên cứu Số liệu nhị phân tiếp tục xử lý phần mềm NTSYSpc 2.11X để tính hệ số tương đồng di truyền xây dựng sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu thể Bảng Bảng cho thấy hệ số di truyền tương đồng di truyền mẫu theo cặp dao động từ 0,48 đến 0,90 Hệ số tương đồng di truyền thấp cặp mẫu M9-M25 (0,48) cho thấy mẫu có quan hệ di truyền cách xa cao cặp mẫu M3M4 (0,90) cho thấy mẫu có quan hệ di truyền tương đối gần Hệ số tương đồng trung bình 0,62, thấp so với nghiên cứu Nguyễn Hoàng Nghĩa cs (2009) hệ số tương đồng trung bình 0,823 cho Mỡ hải nam (Manglietia hainanensis Dandy) Như mức độ tương đồng di truyền 25 mẫu Mỡ ba Vườn Quốc gia Ba Vì khơng cao, hay nói cách khác mức độ đa dạng di truyền mẫu nghiên cứu cao (cao so với lồi M hainanensis) Điều khác biệt vị trí địa lý 74 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Mỡ ba lấy mẫu nghiên cứu, mẫu lấy rải rác cốt 1.000 m, cốt 1.100 m cốt 1.296 m (Đền Bác) Bảng Hệ số tương đồng 25 mẫu M conifera nghiên cứu Xử lý phần mềm thu kết phân nhóm mẫu nghiên cứu theo dạng phân loại (Hình 4) Hình Sơ đồ biểu diễn mối quan hệ di truyền 25 mẫu M conifera nghiên cứu Sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền cho thấy 25 mẫu M conifera nghiên cứu phân thành nhóm A B mức tương đồng di truyền 0,62 Trong đó, PHẦN NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 75 nhóm A gồm mẫu M11 M13 có tương đồng di truyền 0,78 hay khác biệt di truyền 22 % 23 mẫu cịn lại nhóm B mức tương đồng di truyền 0,64 tiếp tục chia thành nhóm nhỏ B1 (gồm 14 mẫu: M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M14, M15, M17) B2 (gồm mẫu: M16, M18, M19, M20, M21, M22, M23, M24, M25) Nhóm nhỏ B1 mức tương đồng di truyền 0,65 chia thành nhánh nhỏ B1.1 gồm mẫu M1 M17 có tương đồng di truyền 0,60 hay có đa dạng di truyền 40%, mẫu thu khu vực khác (cốt 1.000 m cốt 1.100 m); nhánh nhỏ B1.2 gồm 12 mẫu (M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M14, M15), có mẫu M3 M4 thu khu vực (cốt 1.000 m) có tương đồng di truyền cao 25 mẫu M conifera nghiên cứu (r = 0,90) Nhóm nhỏ B2 chia thành nhánh nhỏ B2.1 (gồm mẫu: M16, M18, M19, M20, M22) B2.2 (gồm mẫu: M21, M23, M24, M25) mức tương đồng di truyền 0,74 KẾT LUẬN 25 mẫu Mỡ ba có hệ số tương đồng di truyền cặp nằm khoảng 0,46 đến 0,9 Hệ số tương đồng di truyền thấp cặp M9 M25 (0,48), M1 M23, M2 M11 (0,50) phản ánh thực tế phân bố loài tự nhiên (cách biệt nhau) 25 mẫu Mỡ ba với 11 mồi ngẫu nhiên chia làm nhóm chính, nhóm A gồm mẫu M11 M13; nhóm B: bao gồm 23 mẫu chia thành nhóm nhỏ B1(gồm 14 mẫu: M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M14, M15, M17) B2 (gồm mẫu: M16, M18, M19, M20, M21, M22, M23, M24, M25) Nghiên cứu cho thấy ưu đa dạng nguồn gen di truyền cá thể Mỡ ba quần thể lồi Vườn Quốc gia Ba Vì, góp phần quan trọng lĩnh vực bảo tồn sử dụng nguồn gen hiệu giá trị kinh tế mà loài mang lại TÀI LIỆU THAM KHẢO Đào Xuân Thu, 2011 Nâng cao chất lượng gỗ Mỡ (Manglietia conifera Dandy) rừng trồng phương pháp biến tính hóa học Luận án Tiến sỹ Kỹ thuật Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Dandy, J E., 1930 New Magnolieae from China and Indochina Journal of Botany, British and Foreign 68(7): 205-206 Doyle J J and Doyle J L., 1990 Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus 12(1): 13-15 Nei, M., and Li, W H., 1979 Mathematical model for studying generic variation in terms of restriction endonucleases Proceedings of the National Academy of Science USA, 76(10): 5269-5273 Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Thanh Trăng, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Văn Phượng, Lê Văn Sơn Chu Hồng Hà, 2009 Phân tích đa dạng di truyền hệ gen nhân loài mỡ Hải Nam (Manglietia hainanensis Dandy) thị RAPD cpSSR Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, 2: 918-924 76 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Rohlf, F J., 2000 NTSYSpc: Numerical taxonomy and multivariate analysis system, Version 2.11 Exeter Software, New York Vu Quang Nam, 2011 Taxonomic Revision of the Family Magnoliaceae from Vietnam PhD Dissertation, Graduate University of The Chinese Academy of Sciences, China Vũ Quang Nam, Nguyễn Hà Chi Đặng Văn Hà, 2019 Hiện trạng họ Ngọc lan (Magnoliaceae) Vườn Quốc gia Ba Vì Tạp chí Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp, 8: 117-216 GENETIC DIVERSITY OF Manglietia conifera Dandy AT BA VI NATIONAL PARK BASED ON RAPD MARKERS Vu Quang Nam1,*, Cao Thi Viet Nga1, Nguyen Thien Dat1, Nguyen Gia Hong Duc1 Abstract 25 leaf samples of Manglietia conifera Dandy, which were randomly collected at different areas from the base of 1,000m to the top of 1,296m, were evaluated for genetic diversity with 11 RAPD primers (CP4, CP7, CP8, CP15) , CP17, OPB11, OPB18, OPE14, OPG13, RM1 and RM5) The results show that out of a total of 652 bands, 57 bands are polymorphic The number of amplification products ranged from to for different primers Manglietia conifera samples had a pairwise genetic similarity between 0.46 and 0.9 and a mean of 0.62 This proves that the genetic similarity of Manglietia conifera samples in the Ba Vi National Park is not so high, it is possible to create a hybrid advantage in sexual reproduction to create genetic diversity in the sample groups On the tree diagram, 25 samples of Manglietia conifera samples using 11 RAPD primers were divided into main groups, in which group A included samples M11 and M13; group B: includes 23 samples divided into subgroups B1 (including 14 samples: M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M14, M15, M17) and B2 (including models: M16, M18, M19, M20, M21, M22, M23, M24, M25) This study has shown the advantages of genetic diversity of Manglietia conifera’population in Ba Vi National Park Keywords: Ba Vi National Park, Genetic diversity, Magnoliaceae, Manglietia conifera, RAPD Vietnam National University of Forestry Email: namvq@vnuf.edu.vn; namvq1975@gmail.com ... tổng số 25 mẫu Mỡ ba Ghi chú: Giếng 1-25 tương ứng với 25 mẫu M conifera nghiên cứu (M1-M25) 3.1 Kết phân tích đa dạng di truyền Hiệu sử dụng mồi RAPD phân tích đa dạng di truyền mẫu Mỡ nghiên cứu:... hainanensis Dandy) Như mức độ tương đồng di truyền 25 mẫu Mỡ ba Vườn Quốc gia Ba Vì khơng cao, hay nói cách khác mức độ đa dạng di truyền mẫu nghiên cứu cao (cao so với loài M hainanensis) Điều khác biệt... Tỷ lệ phân đoạn đa hình cao (98,3 %) số phân đoạn ADN trung bình/mẫu dao động lớn cho thấy mức độ đa dạng di truyền mẫu Mỡ ba nghiên cứu cao Bảng Số phân đoạn băng đa hình 11 mồi RAPD phân tích