Nghiên cứu đa dạng di truyền của chim yến (aerodramus spp ) ở khánh hòa dựa trên chỉ thị phân tử cytochrome b của DNA ty thể

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài tại trường Đại Học Nha Trang em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của nhà trường, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đặc biệt là các thầy cô giáo và cán bộ trong Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã truyền những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong những năm học vừa qua. Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa và TS. Đặng Thúy Bình đã tạo điều kiện cho em tham gia thực hiện đề tài này. Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Anh Thư đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn và chỉ bảo giúp em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn Công ty Yến Sào đã giúp đỡ cơ sở vật chất, tạo điều kiện cho em thu mẫu và kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành đề tài này đúng thời hạn. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ động viên của gia đình, bạn bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Mặc dù đã có nhiều cố gắng hoàn thiện đề tài của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn. Nha Trang, tháng 6 năm 2012 Sinh viên Phan Thị Huyền Trân i DANH MỤC VIẾT TẮT µl : Microliter µM : MicroMol BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : Base pair Cytb : Cytochrome b Cytb FW1 : Mồi xuôi (forward primer) Cytb RV1 : Mồi ngược 1 (reverse primer) Cytb RV2 : Mồi ngược 2 (reverse primer) CS : cộng sự cùng nghiên cứu dATP : Deoxyadenosine triphosphate dCTP : Deoxycytidine triphosphate dGTP : Deoxyguanosine triphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate dTTP : Deoxythymidine triphosphate kDa : Kilodalton mtDNA : Mitochondrial DNA_ hệ gen ty thể mM : MilliMol mRNA : RNA thông tin (Messenger RNA) NCBI : National Center for Biotechnology Information SB : Sodium Borate PCR : Polymerase Chain Reaction T a : Annealing temperature (nhiệt độ lai) T m : Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy) ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 1 DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHIM YẾN 3 1.1.1 Hệ thống phân loại 3 1.1.2 Phân bố 5 1.1.3 Đặc điểm hình thái 7 1.1.4 Hành vi, tập tính 9 1.1.5 Khả năng định vị bằng tiếng vang 10 1.1.6 Thức ăn và cách thức bắt mồi 12 1.1.7 Yến Sào (tổ yến) 13 1.1.8 Đặc điểm sinh sản 14 1.1. 8.1 Chu kỳ sinh sản của chim yến 14 1.1.8.2 Mùa vụ sinh sản 17 1.1.9 Một số đặc điểm sinh học khác 17 1.1.9.1 Đời sống tự nhiên của loài chim yến tổ trắng 17 1.1.9.2 Vùng kiếm ăn của chim- môi trường sống vĩ mô (macrohabitat) 17 1.1.9.3 Nơi chim làm tổ- môi trường sống vi mô (microhabitat) 18 1.1.9.4 Sinh trưởng 19 1.1.10 Vấn đề bệnh tật của chim 20 1.2 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 21 1.2.1 Lông chim 21 iii 1.2.2 Hệ gen ty thể (Mitochondrial DNA- mtDNA) 22 1.2.2.1 Cấu trúc DNA ty thể 22 1.2.2.2 Đặc điểm hệ gen ty thể (mtDNA) 24 1.2.2.3 Cytochrome b 25 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM 26 1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới 27 1.3.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam 29 1.4 TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 29 Chƣơng II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 31 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 32 2.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của chim yến (Apodidae) 32 2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 34 2.2.2.2 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 35 2.2.2.3 Điện di gel agarose 38 2.2.2.4 Giải trình tự 39 2.2.2.5 Xử lý số liệu xây dựng cây phát sinh loài 40 Chƣơng III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG SINH HỌC CỦA CHIM YẾN 46 3.1.1 Đặc trƣng sinh học chim yến đảo 46 3.1.2 Đặc trƣng sinh học chim yến nhà 46 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CƢU DI TRUYỀN CHIM YẾN 46 3.2.1 Kiểm tra DNA tổng số 46 iv 3.2.2 Xây dựng chƣơng trình PCR khuếch đại trình tự gen Cytb DNA ty thể 47 3.2.2.1 Thiết kế mồi và kiểm tra đặc tính của mồi trên lý thuyết 47 3.2.2.2 Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện phản ứng PCR 49 3.2.3 Giải trình tự DNA chim yến 52 3.2.4 Đa dạng di truyền A. fuciphagus 52 3.2.4.1 Đa dạng haplotype 52 3.2.4.2 Đa dạng di truyền 54 3.2.5 Đa dạng di truyền quần thể chim yến A. fuciphagus 56 3. 3 THẢO LUẬN 60 3.3.1 Phân loại chim yến (Aerodramus spp.) dựa vào đặc điểm hình thái 60 3.3.2 Hiệu quả phƣơng pháp PCR 60 3.3.3 Đa dạng di truyền quần thể chim yến A. fuciphagus 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số miêu tả đặc điểm hình thái của chim yến hàng 32 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen Cytb của mtDNA 36 Bảng 2.3: Trình tự gen Cytb mtDNA của chim yến sử dụng trong nghiên cứu này 41 Bảng 2.4: Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa (best-fit-model) giữa chim yến Việt Nam với chim yến của thế giới 45 Bảng 3.1: Các đặc tính của mồi 48 Bảng 3.2 Các giá trị phân tích Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus spp 53 Bảng 3.3: Giá trị tương đồng (%) của các haplotype trình tự Cytb mtDNA của chim yến A. fuciphagus thu tại Khánh Hòa, Việt Nam 54 Bảng 3.4: Giá trị tương đồng và giá trị khác biệt (%) của các haplotype trình tự Cytb mtDNA của A. fuciphagus thu tại đảo A2-Hòn Mun-Nha Trang 55 Bảng 3.5: Giá trị tương đồng và giá trị khác biệt (%) của các haplotype trình tự Cytb mtDNA của A. fuciphagus thu tại 155-Thống Nhất-Nha Trang 55 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ của giống Aerodramus dựa trên gen mtDNA trên bản đồ phía Nam và Đông Nam Á 6 Hình 1.2: Bản đồ chim yến Việt Nam của Trung Tâm Eka 7 Hình 1.3: chim yến Aredramus fuciphagus) 8 Hình 1.4: Sự phân bố các loài chim yến được công nhận bởi Chantler 11 Hình 1.5: Mối quan hệ giữa lực vào (Fin) và độ dịch chuyển của giá đỡ 12 Hình 1.6: Tổ chim yến 15 Hình 1.7: Trứng và chim yến con mới nở (www.yensaokhanhhoa.com.vn) 15 Hình 1.8: Chim con 2 ngày tuổi và chim trưởng thành 16 Hình 1.9: Cấu tạo lông chim 21 Hình 1.10: Hệ gen ty thể của các loài chim (a, b) và động vật có vú và Xenopus (c). . 23 Hình 2.1: Địa điểm thu mẫu 31 Hình 2.2 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR 38 Hình 3.1: Hình ảnh điện di DNA tổng số của chim yến 47 Hình 3.2: Cấu trúc kẹp tóc của mồi: a) mồi Cytb RV1; b) mồi Cytb RV2 49 Hình 3.3: Kết quả khảo sát nồng độ cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và 49 Hình 3.4 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi 50 Hình 3.5: Kết quả khảo sát nồng độ DNA từ mẫu lông chim 51 Hình 3.6: Cây đa dạng loài dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus fuciphagus xây dựng theo phương pháp maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và Neighbor Joining (NJ). 57 Hình 3.7: Cây đa dạng loài dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến A. fuciphagus thu tại Khánh Hòa, Việt Nam và một số khu vực khác trên thế giới; Apus apus và Amazilia tzacatl 59 1 MỞ ĐẦU Yến sào hay tổ chim yến, là tên một loại thực phẩm - dược phẩm nổi tiếng được làm bằng tổ chim yến. Đây là món cao lương mĩ vị tại các quốc gia Đông Á như Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, Việt Nam và nhiều quốc gia khác. Theo đông y, tổ yến có vị ngọt, tính bình, tác dụng vào các kinh phế và vị. Có tác dụng dưỡng âm, bổ phế, tiêu đàm, trừ ho định suyễn. Dùng trong các chứng ho hen, khái huyết, suy nhược cơ thể. Thành phần chất đạm trong yến sào cũng rất cao: yến trắng Đà Nẵng (55%), yến huyết Đà Nẵng (54,4%), yến trắng Nha Trang (53,8%), yến huyết Nha Trang (56,9%), yến trắng Quy Nhơn (54,4%). Qua đó, cho thấy chất lượng tổ yến của Việt Nam rất tốt, có giá trị cao được nhiều nước trên thế giới ưa chuộng. Theo luận án tiến sĩ dược khoa tại đại học Dược khoa Sài Gòn năm 1972 của TS Huỳnh Hữu Tạo, có 3 nhóm yến sào phân bố theo vùng địa lý: yến sào quanh vùng Cù Lao Chàm (Quảng Nam-Đà Nẵng). Yến sào quanh vùng Quy Nhơn và yến sào quanh vùng Nha Trang-Cam Ranh. Khánh Hòa là nơi chim yến làm tổ nhiều nhất ở Việt Nam. Hàng năm, Khánh Hòa thu được khoảng hơn 2 tấn tổ yến so với 600-700kg/năm ở Bình Định và Đà Nẵng [22]. Yến sào Khánh Hòa có mùi vị thơm ngon đặc trưng được coi là tổ yến vua và giá cả luôn ở mức cao nhất thế giới [22]. Chính vì những công dụng đặc biệt của tổ chim yến mà trong những năm gần đây, tổ yến đã trở thành đối tượng bị khai thác quá mức. Việc khai thác quá mức trong những thập niên gần đây đã dẫn đến sự suy giảm nguồn lợi tổ chim yến cả về số lượng và chất lượng, số lượng cá thể trong đàn chim yến giảm và sản lượng khai thác tự nhiên không đáp ứng đủ nhu cầu của con người, trong khi đó giá tổ yến trên thế giới không ngừng tăng lên. Vào năm 1975, giá tổ yến là 10USD/kg, năm 1995 là 400 USD/kg và hiện nay giá xô các loại tổ yến bình quân là 1271USD/kg [6]. Điều này đòi hỏi các nhà khoa học phải có các nghiên cứu bảo tồn một cách hợp lí và kịp thời nguồn tài nguyên này. Những nghiên cứu về chim yến ở Việt Nam phần lớn được thực hiện ở mức độ khảo sát, thu thập mẫu và tư liệu liên quan phân loại, mô tả hình thái, giá trị kinh 2 tế của phân loài chim yến hàng (Aerodramus fuciphagus), ấp nở chim yến nhân tạo, nuôi chim trong nhà để lấy tổ, di đàn và nhân đàn chim yến [1], [2], [3], [6], [22], [71]. Hiện nay các nghiên cứu phát sinh chủng loại về chim yến Việt Nam ở mức độ phân tử còn nhiều hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu và xây dựng phát sinh chủng loại các loài chim yến Việt Nam bằng các phương pháp sinh học phân tử là rất cần thiết, nó sẽ góp phần vào công tác bảo tồn và lưu giữ nguồn gen chim yến Việt Nam. Đây chính là cơ sở, nền tảng phát triển quần thể chim yến hàng (tên khoa học Aerodramus fuciphagus_ đang có mặt tại Khánh Hòa cho giá trị thương phẩm cao nhất thế giới) - nguồn tài nguyên thiên nhiên quý hiếm, bảo vệ đa dạng sinh học, bảo tồn động vật hoang dã, tăng sản lượng yến sào xuất khẩu theo định hướng bền vững và góp phần quan trọng phát triển ngành yến sào Việt Nam. Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền của chim yến (Aerodramus spp.) ở Khánh Hòa dựa trên chỉ thị phân tử Cytochrome b của DNA ty thể”. Đề tài này nhằm các mục tiêu chính sau: - Thu mẫu yến đảo và yến nhà ở khu vực Khánh Hòa - Tách chiết DNA từ lông và mô cơ chim yến, chạy PCR sử dụng marker là Cytb, giải trình tự DNA. - Xây dựng cây phát sinh loài của chim yến ở khu vực Khánh Hòa và so sánh với các loài khác trên thế giới. 3 Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHIM YẾN 1.1.1 Hệ thống phân loại Bộ Yến (danh pháp khoa học: Apodiformes) là một bộ chim theo truyền thống gồm ba họ: Họ Yến (Apodidae), họ Yến mào, Yến cây (Hemiprocnidae) và họ Chim ruồi (Trochilidae) [43]. Trong phân loại Sibley-Ahlquist bộ này được nâng cấp lên thành siêu bộ (Apodimorphae). Trong đó, nhóm các loài Chim ruồi được tách ra như một bộ riêng biệt gọi là Trochiliformes nhưng lại tuân theo những miêu tả truyền thống. Với gần 450 loài đã được nhận dạng cho đến nay, bộ này là bộ chim đa dạng hàng thứ hai, chỉ sau bộ Sẻ (Passeriformes) [43]. Họ Yến (Apodidae) là một họ chim có bề ngoài rất giống với các loài nhạn (họ Hirundinidae) nhưng thực ra chúng không có quan hệ họ hàng gần với những loài chim dạng sẻ này. Sự tương tự giữa yến và nhạn là do tiến hóa hội tụ phản ảnh kiểu sinh sống tương tự dựa trên việc bắt các côn trùng làm thức ăn trong khi đang bay [75]. Phân loại yến nói chung là phức tạp, với ranh giới giữa các chi và loài còn nhiều tranh cãi, đặc biệt là ở giống Collocalini. Phân tích hành vi và kiểu phát âm thanh bị thất bại do tiến hóa song song, trong khi các phân tích về các đặc điểm hình thái và các chuỗi DNA khác nhau đã cho ra kết quả không rõ ràng và phần nào đó là mâu thuẫn [75]. Họ yến Apodidae có 98 loài trên thế giới, trong đó tại Việt Nam có 11 loài: - Yến núi Aerodramus brevirostris - Aerodramus rogersi - Aerodramus maximus - Yến hàng Aerodramus fuciphagus - Yến hông xám Aerodramus germane [...]... từ quần thể chim yến làm tổ trên đảo thuộc tỉnh B nh Định [6] Đặng và CS (201 1) nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể chim yến loài A f germani tại Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử Cytochrome b DNA ty thể đã được đăng lên ngân hàng dữ liệu Genbank 1.4 TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Việc phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài dựa trên các đặc điểm hình thái (hình dạng, màu sắc,... một dấu hiệu phân loại đối với các taxon b c cao [48] 1.2.2.3 Cytochrome b Cytochrome b là một trong những cytochrome tham gia vào quá trình vận chuyển electron trong chuỗi hô hấp của ty thể Cytochrome b chứa 8 xoắn màng kết nối b i vùng intramembrane hoặc extramembrane (hình 1.1 1) [20] Cytochrome b chỉ được mã hóa b i DNA ty thể Hình 1.11: Cấu trúc của protein cytochrome b [20] Cytochrome b là gen được... học phân loài chim yến Colloccalia fuciphaga germani (hay còn gọi là Aerodramus fuciphagus germanicus – chim Yến hông xám, Yến hàng) Phân tích di truyền quần thể chim Yến làm tổ ở đảo (tỉnh B nh Định) và trong nhà tại tỉnh B nh Định và Khánh Hòa là các quần thể thuộc loài A fuciphagus Tác giả kết luận: quần thể chim yến làm tổ trên đất liền ở tỉnh B nh Định và tỉnh Khánh Hòa không b t nguồn từ quần thể. .. hồ phân tử DNA ty thể có đặc điểm đơn b i, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn b DNA ty thể thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng mẹ Thêm vào đó DNA ty thể tồn tại với số lượng b n sao lớn trong mỗi tế b o Các đặc điểm trên cùng với việc DNA ty thể b n vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng [34], nên sử dụng DNA ty thể. .. loài chim yến b ng phân tích riêng biệt và kết hợp ba trình tự: ty thể 12S rRNA, Fib 7 và Cytb của 6 chim yến lớn, 2 chim yến nhỏ và một nhóm của loài chim ruồi Kết quả là loài Hydrochous gigas xếp gần gũi với nhánh Aerodramus và các nhóm yến tạo thành nhánh đồng nhất (monophyletic group) [31] Thomassen và CS (200 5) nghiên cứu tiếng vang (âm thanh lách cách) của chim yến và sự xướng âm các quần thể. .. 1.2.2 Hệ gen ty thể (Mitochondrial DNA- mtDNA) 1.2.2.1 Cấu trúc DNA ty thể Hệ gen ty thể là phân tử DNA trần, kép, mạch vòng nhỏ (15-20kb) gồm hai chuỗi: chuỗi nặng (H strand) giàu guanine và chuỗi nhẹ (L strand) giàu cytosine Khác với DNA nhân, mtDNA không liên kết với protein histon, điều này làm cho mtDNA tương tự với DNA của vi khuẩn Hệ gen ty thể chim mang những đặc trưng của hệ gen ty thể động vật... làm cho cytochrome b như là chỉ thị marker tốt nhất HelmBychowski và Cracraft đã cung cấp ví dụ tốt về sự sai khác di truyền thấp trong một nghiên cứu phát sinh loài chim b Sẻ [29] Sự sai khác di truyền gen cytochrome b cho rằng một số phân loài cần được nâng lên đến loài trong Tanager [27], và trong phân loại học của chim yến (Apodidae) dựa trên sự hiện di n hay vắng mặt của khả năng định vị b ng tiếng... của RNA polymerase của ty thể, yếu tố phiên mã của ty thể (mtTFA), các protein ribosome của ty thể, các yếu tố kéo dài chuỗi và các enzyme trao đổi chất của ty thể đều được mã hóa b i DNA nhân [71] B gen ty thể của các loài chim và động vật có vú được mô tả b i Desjardins và Morais (199 0), Mindell và CS (199 8) B gen của ty thể được b trí rất hiệu quả, nó thiếu các intron, có các đoạn đệm giữa các... âm dựa trên cây MP cho thấy mô hình phát sinh loài không phù hợp [30] Aowphol và CS (200 8) nghiên cứu khảo sát mô hình của sự khác biệt di truyền trong hai gen DNA ty thể (Cytb và ND 2) và 8 chỉ thị microsatellites (lặp lại trình tự đơn giản) giữa và trong các quần đàn của A fuciphagus từ đàn nhân tạo mới thành lập ở Thái Lan Lấy mẫu 10 đàn chim yến làm tổ trắng dọc theo b biển của Vịnh Thái Lan và biển... Andaman ở Thái Lan trong thời gian 2003-2006 Sự đa dạng di truyền của mtDNA là rất thấp và giá trị Phist đáng kể đã được tìm thấy giữa các cặp của đàn Phân tích mối quan hệ haplotype không cho thấy cấu trúc di truyền qua phân phối mẫu Mức độ đa dạng di truyền cho các chỉ thị microsatellites là cao, nhưng giá trị Fst là không đáng kể Việc thiếu sự khác biệt di truyền giữa các đàn chim yến nhà có thể là . ngành yến sào Việt Nam. Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu đa dạng di truyền của chim yến (Aerodramus spp. ) ở Khánh Hòa dựa trên chỉ thị phân tử Cytochrome b của DNA ty. hóa (best-fit-model) giữa chim yến Việt Nam với chim yến của thế giới 45 B ng 3.1: Các đặc tính của mồi 48 B ng 3.2 Các giá trị phân tích Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus spp 53 B ng 3.3:. PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 31 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 32 2.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của chim yến (Apodidae)

Định dạng
Số trang	79
Dung lượng	1,99 MB