Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và đa dạng di truyền của một số loài trai tai tượng (tridacna spp ) ven biển khánh hòa và côn đảo

i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các tổ chức và cá nhân. Nhân đây tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đặng Thúy Bình (Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường - Trường Đại học Nha Trang) đã định hướng và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy, cô giáo trong khoa Nuôi trồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang, những người đã dạy dỗ, chỉ bảo và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quãng thời gian qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, những người luôn bên cạnh giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn to lớn đến gia đình và người thân đã luôn động viên giúp tôi vượt qua khó khăn trong suốt những năm học vừa qua. Nha Trang, tháng 06 năm 2012 Học viên Lê Thị Mai Anh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính bản thân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn – Tiến sĩ Đặng Thúy Bình. Các số liệu được chú thích, trích dẫn rõ ràng. Các số liệu trong luận văn là trung thực và lấy từ một phần trong đề tài “Bảo tồn và lƣu giữ nguồn gen các loài ốc cối (Conus spp.) và trai tai tƣợng (Tridacna spp.) ven biển Trung và Nam Bộ, Việt Nam” thuộc đề tài khoa học và công nghệ cấp Bộ đã được sự đồng ý của giáo viên hướng dẫn. Học viên thực hiện Lê Thị Mai Anh iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC BẢNG DANH MỤC CHỮ VIẾT TĂT DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1. Tổng quan về vùng nghiên cứu 4 1.1.1. Vị trí địa lý, thủy văn của Khánh Hòa 4 1.1.2. Vị trí địa lý, thủy văn của Côn Đảo 7 1.2. Một số đặc điểm sinh học của trai tai tượng (Tridacna spp.) 8 1.2.1. Hệ thống phân loại 9 1.2.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố 9 1.2.3. Đặc điểm hình thái 10 1.2.4. Đặc điểm sinh học, sinh sản 13 1.3. Các nghiên cứu về di truyền trai tai tượng (Tridacna spp.) 17 1.3.1. Hệ gen cơ quan tử 17 1.3.2. Tình hình nghiên cứu di truyền trai tai tượng trên thế giới 20 1.3.3. Tình hình nghiên cứu trai tai tượng ở Việt Nam 24 CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 . Địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1. Phương pháp định danh phân loại trai tai tượng 27 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu di truyền trai tai tượng 31 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái phân loại của trai tai tượng 39 3.2. Kết quả nghiên cứu di truyền trai tai tượng 49 3.2.1. Tách chiết DNA, khuếch đại gen và giải trình tự DNA 49 iv 3.2.2. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền và mối quan hệ tiến hóa của trai tai tượng (Tridacna spp.) 51 3.2.3. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể trai tai tượng Tridacna crocea 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Mùa sinh sản của một số loài trai tai tượng 15 Bảng 1.2. Sự khác biệt của mã di truyền ty thể và mã di truyền gen nhân 18 Bảng 2.1. So sánh giải phẫu học màng áo của các loài trai tai tượng 31 Bảng 2.2. Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 32 Bảng 2.3. Trình tự gen 16S, CO1 mtDNA của các loài trai tai tượng 35 Bảng 2.4. Thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa (best fit models) của phân tích đa dạng loài Tridacna spp. được lựa chọn bởi phần mềm Modeltest 3.7, sử dụng tính năng Akaike Information Criterion 36 Bảng 2.5. Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa (best fit models) của phân tích di truyền quần thể loài Tridacna crocea được lựa chọn bởi phần mềm Modeltest 3.7, sử dụng tính năng Akaike Information Criterion 37 Bảng 3.1. Các chỉ tiêu phân loại của trai tai tượng (Tridacna spp.) 39 Bảng 3.2. Số lượng mẫu trai tai tượng tách chiết DNA 49 Bảng 3.3. So sánh sự khác biệt về trình tự gen 16S mtDNA của các loài trai tai tượng trong nghiên cứu hiện tại và trên Ngân hàng Gen (%) 51 Bảng 3.4. So sánh sự khác biệt về trình tự gen CO1 mtDNA của các loài trai tai tượng trong nghiên cứu hiện tại và trên Ngân hàng Gen (%) 52 Bảng 3.5. Kết quả phân tích đa dạng di truyền của T. crocea ở Khánh Hòa và Côn Đảo 59 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vùng biển Khánh Hòa và khu vực nghiên cứu 4 Hình 1.2. Vùng biển Bà Rịa - Vũng Tàu và khu vực nghiên cứu 7 Hình 1.3. Một số loài trai tai tượng trên thế giới (Theo CRRF, Palau) 13 Hình 1.4. Mô phỏng chu kỳ sinh sản và vòng đời của trai tai tượng 16 Hình 1.5. DNA ty thể người 18 Hình 1.6. Cấu trúc hệ gen ribosome 19 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu hình thái và đa dạng di truyền trai tai tượng 28 Hình 2.2. Đo kích thước của trai tai tượng 29 Hình 2.3. Hình dạng ngoài của trai tai tượng 29 Hình 2.4. Quan sát màng áo của trai tai tượng từ mặt lưng 30 Hình 2.5. Quan sát mặt bên màng áo của trai tai tượng 30 Hình 3.1. Đặc điểm hình thái vỏ của Tridacna squamosa 40 Hình 3.2. Đặc điểm hình thái vỏ của Tridacna crocea 42 Hình 3.3. Đặc điểm hình thái vỏ của Tridacna maxima 44 Hình 3.4. Đặc điểm hình thái vỏ của Tridacna sp. 46 Hình 3.5. So sánh trình tự gen 16S mtDNA (A), CO1mtDNA (B) của Tridacna sp., Tridacna sp. YTC2005 và T. maxima. Ký tự có đánh dấu là chỉ sự khác biệt giữa các nucleotide 49 Hình 3.6. Kết quả điện di DNA tổng số của trai tai tượng 50 Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CO1 mtDNA (A) và 16S mtDNA (B) của các mẫu trai tai tượng. Giếng 1: marker 1kb, giếng 1-6: sản phẩm PCR của trai 51 Hình 3.8. Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA của trai tai tượng thu tại vùng biển Khánh Hòa và Côn Đảo; Acanthocardia echinata và A. tuberculata là nhóm ngoại (outgroup). Các giá trị bootstrap (phân tích MP, NJ) và giá trị tin cậy (phân tích BI) được biểu hiện trên các nhánh. Hình thái ngoài của các loài trai tai tượng được minh họa qua hình ảnh. 55 Hình 3.9. Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của trai tai tượng tại vùng biển Khánh Hòa và Côn Đảo, Việt Nam; Acanthocardia echinata và A. tuberculata là nhóm ngoại (outgroup). Các giá trị bootstrap (phân tích MP, NJ) và giá trị tin cậy (phân tích vii BI) được biểu hiện trên các nhánh. Hình thái ngoài của các loài trai tai tượng được minh họa qua hình ảnh 56 Hình 3.10. Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của trai tai tượng Tridacna crocea tại vùng biển Khánh Hòa và Côn Đảo, và một số vùng biển thuộc Châu Á; T. squamosa và T. maxima là nhóm ngoại (outgroup). Các giá trị bootstrap (phân tích MP, NJ) và giá trị tin cậy (phân tích BI) được biểu hiện trên các nhánh. 61 Hình 3.11. Mạng lưới haplotype thu từ 100 trình tự gen CO1 mtDNA của T. crocea ở vùng biển Việt Nam và Châu Á. Các đường nối giữa các vòng tròn thể hiện một bước đột biến. Đường gạch và số thể hiện việc cộng thêm các bước đột biến. Kích cỡ của vòng tròn thể hiện số lượng trình tự gen. Từng màu sắc tương ứng với từng khu vực thu mẫu 62 Hình 3.12. Bản đồ khu vực biển Đông thể hiện các địa điểm thu mẫu Tridacna crocea và các dòng chảy chính của đại dương (Wyrtki 1961; Gordon và Fine 1996; Gordon 2005). Các vòng tròn có màu sắc khác nhau tương ứng với các khu vực thu mẫu. Dấu mũi tên liền thể hiện dòng chảy theo một chiều. Dấu mũi tên đứt thể hiện dòng chảy theo hai chiều 66 Hình 3.13. Dòng chảy theo mùa ở biển Đông tính từ bề mặt đến độ sâu 300 m. a) mùa đông, b) mùa xuân, c) mùa hè, d) mùa thu. Mũi tên màu đỏ thể hiện các khu vực thu mẫu có trong phạm vi bản đồ (Yang và cộng sự, 2002) 67 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosin triphosphat bp Base pair – đơn vị tính số nucleotide CITES Convention on International Trade in Endangered Species – Công ước Quốc tế về buôn bán các loài động vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng cs Cộng sự DNA Acid Deoxyribo Nucleic ĐVTM Động vật than mềm Kb Kilo base – đơn vị tính số nucleotide (1kb = 1000bp) MMDC Micronesian Mariculture Demonstration Center – Trung tâm trình diễn nuôi trồng hải sản Micronesia MPA Marine protected areas – Khu bảo tồn biển mtDNA Mitochondrial – Hệ gen ty thể n Kích thước mẫu thí nghiệm PCR Polymerase Chain Reaction – Phản ứng khuếch đại gen rDNA Ribosomal DNA – Hệ gen ribosom RNA Acid ribonucleic rRNA ARN riboxom TC Tridacna crocea tRNA ARN vận chuyển WWF World Wildlife Fund – Quỹ Quốc tế về Bảo vệ Thiên nhiên 1 MỞ ĐẦU Trai tai tượng (họ Tridacnidae) là những loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ có giá trị cao ở nhiều khía cạnh khác nhau. Chúng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cảnh và trang trí do có kích thước lớn, màu sắc khoang vỏ đa dạng, sặc sỡ [32]. Ngoài ra, thịt trai được cho là có hàm lượng dinh dưỡng cao, chứa nhiều acid béo không no mạch dài, acid amin cần thiết cũng như các nguyên tố vi lượng [10]. Vì thế, việc khai thác trai tai tượng đã diễn ra rộng khắp trên thế giới nhằm phục vụ cho nhu cầu ngày càng cao của con người. Trai tai tượng có nguồn gen quí hiếm, giữ vai trò quan trọng trong hệ sinh thái rạn san hô [61]. Do đó, việc khai thác bừa bãi trai đã ảnh hưởng không nhỏ đến sinh thái của rạn. Cụ thể ở những vùng biển giữa Đài Loan và Australia, Solomon và Papua New Guinea nguồn lợi trai tai tượng đang bị suy giảm. Điều đáng quan ngại hơn là việc khai thác trai tai tượng đã làm cho vùng rạn san hô ngầm của Australia bị đe dọa nghiêm trọng [38]. Trên thế giới, người ta đã nhận thấy vai trò quan trọng trong sinh thái và giá trị kinh tế của trai tai tượng nên từ những năm 1980 nhiều nước đã tiến hành triển khai các hoạt động nghiên cứu phục hồi, tái tạo nguồn lợi trai tai tượng và đã đạt được những thành công nhất định. Từ năm 1986, tổ chức MMDC (Micronesian Mariculture Demonstration Center) thuộc nước Cộng hòa Palau đã cung cấp và thả nuôi thử nghiệm khoảng 1.000 con giống loài Tridacna derasa xuống vùng rạn san hô tại đảo Cook (New Zealand) để bổ sung nguồn lợi tự nhiên 26]; từ năm 1997 – 1998, ở các đảo Solomon, Fiji, Cook và phía tây đảo Samoa, con giống được thả ra biển nhằm tăng cường nguồn lợi tự nhiên hoặc đáp ứng nhu cầu cho các thị trường Nhật Bản, Trung Quốc, Hồng Kông và Đài Loan [19]. Năm 2008, tại Philippine đã triển khai chương trình “phục hồi nguồn lợi trai tai tượng khổng lồ T. gigas” tại 50 vùng rạn san hô khác nhau (theo Quỹ Quốc tế về Bảo vệ Thiên nhiên (WWF), Philippine 2008) [9]… Ở Việt Nam, trong nhiều năm gần đây, nguồn lợi trai tai tượng đang bị giảm sút nhanh chóng, một số loài có nguy cơ bị đe dọa tuyệt chủng do khai thác quá mức và đã được liệt kê vào danh mục Sách Đỏ Việt Nam (năm 2002, 2007) như loài T. gigas [3]. Cho đến nay ở nước ta đã có một số công trình nghiên cứu liên quan đến nguồn lợi và 2 công tác phục hồi, phát triển nguồn lợi trai tai tượng như đề tài “Nghiên cứu phục hồi và phát triển nguồn lợi trai tai tượng (họ Tridacnidae) ở biển Việt Nam” của Viện Nghiên Cứu Hải Sản, 2010; hay công tác khảo sát và di dời trai tai tượng từ các khu vực phân bố xa trung tâm quản lý về khoanh nuôi bảo vệ tại vịnh Đầm Tre – Côn Đảo – Vũng Tàu từ năm 2005 – 2007… Tuy nhiên, hầu như các công trình nghiên cứu chưa được thực hiện đầy đủ và đồng bộ. Các nghiên cứu liên quan đến đặc điểm sinh học, sinh thái, đa dạng di truyền… của các loài trai tai tượng còn rất hạn chế. Nhằm góp phần cung cấp dữ liệu đầu vào cho công tác bảo tồn quần đàn của trai tai tượng ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và đa dạng di truyền của một số loài trai tai tượng (Tridacna spp.) ven biển Khánh Hòa và Côn Đảo”. Mục tiêu của đề tài  Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu đa dạng sinh học, phân bố và mối quan hệ tiến hóa của các loài trai tai tượng (Tridacna spp.) phân bố ở hai vùng biển Khánh Hòa và Côn Đảo.  Mục tiêu cụ thể: - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, đa dạng loài, đặc điểm di truyền và mối quan hệ tiến hóa các loài trai tai tượng (Tridacna spp.). - Nghiên cứu đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể loài trai tai tượng làm cơ sở cho công tác bảo tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Nội dung nghiên cứu - Đặc điểm hình thái, phân loại của các loài trai tai tượng thu được và kiểm chứng phân loại bằng giải trình tự DNA ty thể (16S mtDNA và CO1 mtDNA) của các loài có hình thái chưa rõ nét. - Giải trình tự DNA ty thể, phân tích dữ liệu giải mã DNA. - Xây dựng cây phát sinh chủng loài đối với các loài trai tai tượng thu được ở vùng biển Khánh Hòa và Côn Đảo. - Phân tích đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền quần thể của loài trai tai tượng T. crocea [...]... gian và đối tƣợng nghiên cứu - Địa điểm thực hiện: Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại học Nha Trang - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 5/2011 đến tháng 5/2012 - Đối tượng nghiên cứu: Các loài trai tai tượng (Tridacna spp. ) được thu tại vịnh Nha Trang và vịnh Vân Phong (tỉnh Khánh Hòa) và Côn Đảo (tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu) từ tháng 5 – 12 năm 2011 Đối tượng cho nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa. ..  Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể trai tai tượng (Tridacna spp. ) Hiện nay, trên thế giới nhiều công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của trai tai tượng đã được thực hiện, nhằm bảo tồn và lưu giữ nguồn gen quý hiếm này Benzie và Williams (199 5) đã nhận thấy sự khác biệt về cấu trúc di truyền giữa các quần thể của Tridacna gigas còn lại trên thế giới khi so sánh đa dạng. .. 1.3 Các nghiên cứu về di truyền trai tai tƣợng (Tridacna spp. ) 1.3.1 Hệ gen cơ quan tử Hầu hết bộ gen của các cơ quan tử có dạng phân tử DNA mạch vòng đơn Bộ gen của cơ quan tử mã hóa cho một số protein đặc trưng ở trong các cơ quan đó Do trong một tế bào có nhiều cơ quan tử nên có nhiều bộ gen của các cơ quan tử trên một tế bào  Hệ gen ty thể (Mitochondrial DNA - mtDNA) Ty thể là bào quan nhỏ của tế... sinh loài của các loài tảo sống cộng sinh (zooxanthellate) với động vật thân mềm hai mảnh vỏ thuộc hai họ Tridacnidae (Tridacna, Hippopus) và họ Cardiidae (Fragum, Corculum) Kết quả thu được ba cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ (T maxima (T crocea + T squamosa )) , (T crocea (T squamosa + T maxima )) và (T squamosa (T.crocea + T maxima )) [47] Schneider và O'Foighil (199 9) nghiên cứu mối quan hệ của. .. hình nghiên cứu di truyền trai tai tượng trên thế giới  Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và phát sinh loài DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích đa dạng của các loài thuộc lớp chân bụng (gastropoda) và các loài thuộc lớp hai mảnh vỏ [33] Các chỉ thị phân tử (marker) chuẩn của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa cho cytochrome b mitochrondrial DNA (cytb mtDNA),... được tiến hành dựa vào sự di chuyển gen của chúng trong khu vực GB Benzie và Willams (199 7) khảo sát sự đa dạng di truyền tại 8 locus đa hình của 19 quần thể trai tai tượng Tridacna maxima ở khu vực tây và trung tâm Thái Bình Dương Kết quả cho thấy kiểu đa dạng di truyền đã được quan sát ở loài T gigas trước đây [20, 21] không phù hợp với loài này và có thể phản ánh cấu trúc di truyền cơ bản của các loài. .. thông qua mối quan hệ cộng sinh với một số loài tảo quang hợp (zooxanthelle) (như Symbiodinium microadriaticum) sống bám trên phần mô màng áo nhô ra ngoài vỏ của trai để lấy nguồn dinh dưỡng nuôi cơ thể [57] Các loài tảo này quang hợp tạo ra đường, axit amin, axit béo, sau đó một phần dinh dưỡng này sẽ chuyển vào mạch máu của trai tai tượng và qua màng tế bào của tảo Chính vì thế, trai tai tượng chỉ... lưng Mặt trước của tất cả các loài trai đều có tơ chân để bám vào vật bám Các công trình nghiên cứu của Rosewater (1965, 198 2) [54, 55] và Lucas (198 8) [44] đã mô tả khá chi tiết về phân bố địa lý và khóa phân loại của các loài trai tai tượng trên thế giới Một trong những đặc điểm phân loại chủ yếu và khác biệt với các loài động vật thân mềm (ĐVTM) hai mảnh vỏ khác là các loài trai tai tượng nói chung... mtDNA) và cytochrome oxidase c subunit 1 mitochondrial DNA (CO1 mtDNA) 21 Cho đến nay, trên thế giới nhiều công trình nghiên cứu về sự phát sinh loài trai tai tượng đã được thực hiện Tuy nhiên, mối quan hệ phát sinh chủng loài của chúng vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để Muruyama và cộng sự (199 8) sử dụng một phần trong chuỗi trình tự của gen 18S DNA ribosom (rDNA) để nghiên cứu mối quan hệ. .. nhiều loài động vật quý hiếm như rùa biển, cá heo, bò biển (dugong)… Sự đa dạng sinh học của vùng biển Côn Đảo có ý nghĩa quốc gia về bảo tồn thiên nhiên biển ở Việt Nam Hình 1.2 Vùng biển Bà Rịa - Vũng Tàu và khu vực nghiên cứu (vƣờn Quốc gia Côn Đảo, vùng có dấu mũi tên màu đ ) (Nguồn: Google Map) Côn Đảo là một vùng đảo tương đối xa bờ, hoạt động của con người chưa làm biến đổi lớn tính tự nhiên của . cứu mối quan hệ tiến hóa và đa dạng di truyền của một số loài trai tai tượng (Tridacna spp. ) ven biển Khánh Hòa và Côn Đảo . Mục tiêu của đề tài  Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu đa dạng. điểm di truyền và mối quan hệ tiến hóa các loài trai tai tượng (Tridacna spp. ). - Nghiên cứu đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể loài trai tai tượng làm cơ sở cho công tác bảo tồn các loài. gen và giải trình tự DNA 49 iv 3.2.2. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền và mối quan hệ tiến hóa của trai tai tượng (Tridacna spp. ) 51 3.2.3. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền và