Tách chiết DNA trai tai tượng
Các cá thể trai tai tượng sau khi thu sẽ được tiến hành tách chiết DNA (bằng bộ kit Promega). Số lượng mẫu dung dịch DNA tách chiết của từng loài trai tai tượng được trình bày tại Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Số lƣợng mẫu trai tai tƣợng tách chiết DNA Vị trí thu mẫu
Loài
T. crocea T. maxima T. squamosa Tridacna sp.
Khánh Hòa 30 6 3 2
Côn Đảo 34 0 0 0
Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarrose 1,5% để kiểm tra chất lượng tách chiết DNA trai tai tượng được thể hiện trên Hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả điện di DNA tổng số của trai tai tƣợng
Dòng M: DNA marker; dòng 1 – 5: DNA trai tai tượng
Kết quả điện di là một băng đậm nét. Qua đó cho chúng ta thấy, sản phẩm DNA cho dải dài sáng rõ, chứng tỏ bộ kit được sử dụng phù hợp cho việc tách chiết DNA của các loài trai tai tượng. Chất lượng DNA tách chiết tốt, hàm lượng DNA cao đảm bảo yêu cầu cho quá trình khuếch đại gen sau này.
Khuếch đại, giải trình tự DNA trai tai tượng
Sử dụng DNA tổng số của các cá thể trai tai tượng làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu (16S, CO1-Tricro) và chu trình nhiệt như đã trình bày ở Phần 2.2.2, sản phẩm PCR thu được là một băng DNA duy nhất, sắc nét có kích thước đúng như tính toán lý thuyết (550bp đối với gen 16S, 450bp với gen CO1) (Hình 3.7). Điều này cho thấy các cặp mồi có tính đặc hiệu cao và chu trình nhiệt đã được tối ưu cho việc nhân gen.
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CO1 mtDNA (A) và 16S mtDNA (B) của các mẫu trai tai tƣợng. Giếng 1: marker 1kb, giếng 1-6: sản phẩm PCR của trai
3.2.2. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền và mối quan hệ tiến hóa của trai tai tượng (Tridacna spp.)
a) So sánh trình tự
So sánh trình tự gen 16S mtDNA của các loài trai tai tượng
Kết quả dóng hàng 4 trình tự gen của các loài trong nghiên cứu hiện tại (T. crocea, T. maxima, T. squamosa và Tridacna sp.), 4 trình tự gen tương ứng với chúng trên Ngân hàng Gen được thể hiện ở Bảng 3.3.
Dựa vào kết quả ở Bảng 3.3 ta thấy trình tự gen của các loài trai tai tượng trong nghiên cứu hiện tại có sự khác biệt. Trình tự gen của T. crocea và T. squamosa có sự khác biệt thấp nhất (3%). Trình tự gen của T. maxima so với T. squamosa là cao nhất (5,7%) và có trình tự khác biệt với Tridacna sp. là 4,7%.
Bảng 3.3. So sánh sự khác biệt về trình tự gen 16S mtDNA của các loài trai tai tƣợng trong nghiên cứu hiện tại và trên Ngân hàng Gen (%)
Loài 1 2 3 4 5 6 7 8 1 Tridana sp. - 2 T sp. YCT2005 0 - 3 T. maxima 4,7 4,7 - 4 T. maximagb 4,7 4,7 0 - 5 T. crocea 3,7 3,7 5,7 5,7 - 6 T. croceagb 3,7 3,7 5,4 5,4 1,3 - 7 T. squamosa 4,2 4,2 5,4 5,4 3,0 3,2 - 8 T. squamosagb 4,4 4,4 5,2 5,2 3,2 3,5 0,3 -
Các chữ số ở hàng ngang trên cùng tương ứng với từng loài ở cột “Loài”
Bên cạnh đó, khi so sánh sự tương đồng giữa các trình tự gen trai tai tượng thu được ở Việt Nam với thế giới, ta thấy trình tự gen 16S mtDNA của T. maxima tương
tự với trình tự loài này từ Ngân hàng Gen (mã số AM909741). Trình tự tương đồng (ký hiệu Tridacna sp.) với Tridacna sp.YCT2005 (DQ119339) được ghi nhận. Trình tự 16S mtDNA của T. squamosa và T. crocea có sự khác biệt với trình tự của T. squamosa (EU003615) và T. crocea (AM909752) lần lượt là 0,3% và 1,3%.
Kết quả so sánh trình tự gen CO1 mtDNA của các loài trai tai tượng
Kết quả dóng hàng trình tự gen CO1 mtDNA của các loài trai tai tượng trong nghiên cứu hiện tại (bao gồm T. crocea, T. maxima, T. squamosa và Tridacna sp.) và các trình tự gen tương ứng với chúng (lấy từ Ngân hàng Gen) được thể hiện ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. So sánh sự khác biệt về trình tự gen CO1 mtDNA của các loài trai tai tƣợng trong nghiên cứu hiện tại và trên Ngân hàng Gen (%)
Loài 1 2 3 4 5 6 7 8 1 T. crocea - 2 T. croceagb 1,3 - 3 Tridana sp. 15,2 15,2 - 4 T sp. YCT2005 14,7 14,7 1,3 - 5 T. squamosa 10,2 9,4 13,3 12,3 - 6 T. squamosagb 2,2 2,0 15,0 15,0 2,8 - 7 T. maxima 14,5 13,8 14,7 14,3 13,8 14,5 - 8 T. maximagb 14,5 13,8 14,7 14,3 13,8 14,5 0 -
Các chữ số ở hàng ngang trên cùng tương ứng với từng loài ở cột “Loài”
Kết quả so sánh cho thấy, trình tự gen của T. crocea và T. squamosa trong nghiên cứu hiện tại có tỷ lệ tương đồng cao nhất (89,8%). Sự khác biệt về trình tự gen CO1 mtDNA của Tridacna sp. so với T. crocea là cao nhất (15,2%) và có sự khác biệt với
T. maxima là 14,7%
Ngoài ra, kết quả được trình bày ở Bảng 3.4 cho thấy trình tự gen CO1 mtDNA của T. maxima trong nghiên cứu hiện tại tương tự với trình tự của loài này trên Ngân hàng Gen (EU0003614). Trình tự tương đồng (ký hiệu Tridacna sp.) với loài Tridacna
sp. YCT2005 trên Ngân hàng Gen (mã số DQ68140) cũng được ghi nhận. Tuy nhiên, trình tự gen của hai loài này cũng có sự khác biệt nhất định (1,3%). Trình tự gen CO1 mtDNA của loài T. squamosa và T. crocea có sự khác biệt với trình tự của 2 loài này từ Ngân hàng Gen (JN392039 và JN392066) lần lượt là 2,8% và 1,3%.
Thảo luận:
Hiện nay, các chỉ thị phân tử đang được sử dụng rộng rãi và ngày càng đóng một vai trò quan trọng trong những nghiên cứu định danh loài, mối quan hệ tiến hóa cũng như di truyền quần thể. Chỉ thị phân tử được sử dụng chủ yếu là các gen của hệ gen DNA ty thể (16S RNA, 12S RNA, Cytochrom b) và DNA bộ gen (18S rRNA, 28S rRNA, EF1-α, và Histone H3) [4].
Để nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa của các loài trai tai tượng đã có nhiều công trình nghiên cứu được thực hiện với nhiều đoạn gen khác nhau. Các tác giả như Maruyama và cộng sự (1998) sử dụng một phần trình tự gen 18S của DNA ribosom (18S rDNA) [47], Schneider và O'Foighil (1999) sử dụng 16S DNA ty thể [56] hay Nuryanto và cộng sự (2007) sử dụng trình tự gen CO1 mtDNA [49] để phân tích mối quan hệ phát sinh loài của trai tai tượng.
Trong nghiên cứu hiện tại đã sử dụng hai gen 16S và CO1 mtDNA để dóng hàng trình tự gen của các loài trai tai tượng. Kết quả nghiên cứu cho ta thấy sự đa dạng trong loài cũng như giữa các loài tương đối cao và phù hợp cho các nghiên cứu về định danh, xây dựng cây phát sinh loài ở các mức độ khác nhau.
Kết quả dóng hàng trình tự gen 16S mtDNA cho thấy tỷ lệ khác biệt giữa các loài trong nghiên cứu hiện tại là từ 3 – 5,7% (Bảng 3.3). Sự khác biệt trình tự khi so sánh bằng gen CO1 mtDNA cho kết quả khác biệt từ 10,2% - 15,2% (Bảng 3.4), tỷ lệ này cho thấy sự khác biệt trình tự gen của các loài trai tai tượng là tương đối lớn và hoàn toàn đủ cơ sở để phân tách các cá thể thu được thành các loài riêng biệt.
Sự khác biệt trình tự gen CO1 lớn hơn gen 16S trong nghiên cứu này là hoàn toàn phù hợp với đặc tính của từng gen. Theo Hebert và cộng sự (2003), gen CO1 mtDNA có tỷ lệ đột biến cao hơn gấp 3 lần so với gen 16S rDNA [49]. Gen CO1 có mức độ khác biệt về trình tự nucleotide cao giữa các loài và thấp trong cùng một loài (Bảng 3.4). Do đó, sử dụng gen CO1 sẽ cung cấp những chuẩn đoán chính xác, hữu hiệu và thích hợp trong việc định danh và phân loại loài, đặc biệt trong việc đánh giá hệ thống phân tử và xây dựng mô hình tiến hóa của các loài trai tai tượng.
Ngoài ra trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện loài có hình thái rất giống với
T. maxima nhưng có sự khác biệt trình tự gen khá lớn (4,7% gen 16S và 14,7% gen CO1). Trình tự này tương đồng với trình tự Tridacna sp.YCT2005 từ Ngân hàng Gen. Vì vậy, có thể khẳng định hai loài Tridacna sp. và T. maxima là các loài cận giống.
Loài T. maxima có phân bố địa lý rộng nhất trong các loài trai tai tượng. Loài này phân bố từ bờ biển phía Đông Châu Phi đến phía Nam Châu Á và lên đến quần đảo Polynesia của Pháp [31, 44, 46, 54]. Dưới tác động của các nhân tố tiến hóa như đột biến, chọn lọc tự nhiên, sự di chuyển gen hay sự cách ly về vùng địa lý… loài T. maxima xuất hiện các biến dị di truyền và hình thành nên các loài mới có những đặc điểm hình thái tương đồng. Do đó, nếu chỉ dựa vào đặc điểm hình dạng bên ngoài thì rất khó để định danh, phân loại chúng một cách chính xác. Tuy nhiên, sự khác biệt trình tự gen 16S và CO1 mtDNA trong nghiên cứu này là đủ lớn để phân biệt các loài trên.
b) Xây dựng cây phát sinh loài
Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA
Sau khi so sánh và dóng hàng trình tự, 417 bp được sử dụng cho việc phân tích mối quan hệ tiến hóa. Các thông số trình tự gen 16S mtDNA được trình bày ở Bảng 2.3 và 2.4
Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự gen 16S dựa trên 3 phương pháp Maximum Parsimony (MP), Neighbor joining (NJ) và Bayesain inference (BI) cho kết quả tương tự về cây đa dạng loài. Kết quả được trình bày ở Hình 3.8 với cây đa dạng loài thu được từ phân tích MP và NJ có giá trị BT và giá trị tin cậy (PP) của thuật toán BI được thể hiện trên các nhánh.
Hình 3.8. Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA của trai tai tƣợng thu tại vùng biển Khánh Hòa và Côn Đảo; Acanthocardia echinata và A. tuberculata là nhóm ngoại (outgroup). Các giá trị bootstrap (phân tích MP, NJ) và giá trị tin cậy (phân tích BI) đƣợc biểu hiện trên các nhánh. Hình thái ngoài của các loài trai tai tƣợng đƣợc minh họa qua hình ảnh.
Qua Hình 3.8 ta thấy các loài trai tai tượng phân thành 2 nhánh với giá trị BT và độ tin cậy lớn (MP 95%, NJ 56%, PP 95%). Nhánh 1 gồm các loài thuộc Tridacna (T. crocea, T. squamosa, T. maxima, T. derasa và T. gigas) và loài Tridacna sp. thể hiện sự đồng dạng (mornophyletic group) với giá trị BT và độ tin cậy cao (95% MP, 95% PP). Cây phát sinh loài cho thấy T. squamosa xếp cùng nhánh với T. crocea (MP 97%, NJ 50%, PP 98%), T. maxima được xếp cùng nhánh với T. costata và có mối quan hệ
95/82/90 95/56/95 85/100/83 99/53/98 97/50/98 95/62/95
gần gũi với Tridacna sp. Nhánh 2 gồm 2 loài thuộc giống Hippopus (H. Hippopus và
H. porcellanus) lập thành nhóm đồng dạng (MP 100%, NJ 100%, PP 100%). Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA
Sau khi so sánh và dóng hàng trình tự, 499 bp được sử dụng cho việc phân tích mối quan hệ tiến hóa. Các thông số trình tự gen CO1 mtDNA trình bày trong Bảng 2.3 và 2.5.
Hình 3.9. Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của trai tai tƣợng tại vùng biển Khánh Hòa và Côn Đảo, Việt Nam; Acanthocardia echinata và A. tuberculata là nhóm ngoại (outgroup). Các giá trị bootstrap (phân tích MP, NJ)
và giá trị tin cậy (phân tích BI) đƣợc biểu hiện trên các nhánh. Hình thái ngoài của các loài trai tai tƣợng đƣợc minh họa qua hình ảnh
Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự gen CO1 dựa trên 3 phương pháp Maximum Parsimony (MP), Neighbor joining (NJ) và Bayesain inference (BI) cho kết
quả tương tự về cây đa dạng loài. Kết quả trình bày ở Hình 3.9 với cây đa dạng loài thu được từ phân tích MP, NJ với giá trị BT và độ tin cậy (PP) của phân tích BI được thể hiện trên các nhánh.
Qua Hình 3.9 ta thấy các loài trai tai tượng thuộc giống Tridacna thể hiện sự đồng dạng (mornophyletic group) với giá trị BT và độ tin cậy cao (MP 100%, NJ 100%, PP 100%). Ngoài ra, cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 còn cho ta thấy mối quan hệ tương tự giữa T. squamosa và T. crocea. Hai loài này có quan hệ gần gũi với
Tridacna sp, T. maxima, T. gigas. Loài T. derasa tách riêng thành một nhánh phân loại, không có quan hệ tương đồng với các loài khác.
Thảo luận:
Đặc điểm hình thái của một loài có thể chịu tác động của môi trường và các nhân tố tiến hóa để tạo ra các biến dị cá thể cùng loài (Intraspecific) và khác loài (Interspecific). Do đó, quá trình định danh, phân loại loài dễ có sự nhầm lẫn giữa các cá thể.
Trai tai tượng là một đối tượng nuôi biển được quan tâm nhiều do những giá trị về kinh tế cũng như tầm quan trọng của nó với môi trường [44]. Chính vì vậy, để xem xét mối quan hệ tiến hóa của các loài trai tai tượng, một số nghiên cứu đã được thực hiện để khảo sát và xây dựng mô hình phát sinh loài của chúng. Tuy nhiên, các kết quả thu được thường không đồng nhất, đặc biệt là mối quan hệ tiến hóa của các loài trong phân giống Chametrachea.
Maruyama và cộng sự (1998) sử dụng một phần trong chuỗi trình tự của gen 18S rDNA để nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa của các loài trai tai tượng và đã thu được ba cây phát sinh loài, bao gồm Tridacna maxima (T. crocea + T. squamosa)), (T. crocea
(T. squamosa + T. maxima)) và (T. squamosa (T.crocea + T. maxima)). Mỗi cây có một giá trị bootstrap (BT) tương tự nhau được thể hiện tại nhánh của phân giống
Chametrachea [47].
Vào năm 1999, Schneider và O'Foighil dựa trên trình tự của gen 16S rDNA [56] cho thấy mối quan hệ giống như cây thứ hai của Maruyama và cộng sự (1998). Bằng phương pháp sử dụng các biến thể allozyme thuộc 26 loci, Benzie và Williams (1998) khẳng định rằng họ Tridacnidae chia làm 2 giống, bao gồm Hippopus, Tridacna và các phân giống trong giống Tridacna. Trong phân giống Chametrachea, mối quan hệ giữa
các loài trai tai tượng được thể hiện (T. squamosa (T. crocea + T. maxima)) [23]. Như vậy, việc sử dụng nhiều loại chỉ thị phân tử khác nhau vẫn không cho kết quả đồng nhất về mối quan hệ tiến hóa trong phân giống Chametrachea của Tridacna. Nuryanto và cộng sự (2007) sử dụng trình tự gen CO1 mtDNA cho thấy T. crocea có quan hệ gần gũi với T. squamosa hơn là T. maxima. Hai loài T. crocea và T. squamosa
lập được nhóm đồng nhất với nhau và nhóm gần gũi với T. maxima và T. gigas. Mối quan hệ gần gũi giữa T. crocea và T. squamosa được chứng minh bởi mức độ tương đồng cao của trình tự nucleotide (94,3%), điều này phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây sử dụng gen 16S rDNA và 18S rRNA [49].
Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi sử dụng hai chỉ thị phân tử là 16S và CO1 mtDNA để xem xét mối quan hệ tiến hóa của bốn loài trai tai tượng T. crocea, T. maxima, T. squamosa và Tridacna sp. thu được ở 2 vùng biển của Việt Nam với các loài trai tai tượng trên thế giới (sử dụng các trình tự từ Ngân hàng Gen).
Kết quả nghiên cứu cho thấy, chỉ thị gen 16S mtDNA đã phân chia các loài trai tai tượng hai nhánh riêng biệt (Hình 3.8). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đó sử dụng các chỉ thị phân tử 18S rDNA, 16S rDNA và CO1 mtDNA [47, 56, 49]. Hai gống (Hippopus và Tridacna) thể hiện sự đồng dạng. Ngoài ra, kết quả phân tích sự phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA cho thấy loài có đặc điểm hình thái giống với T. maxima (Tridacna sp.) lập thành nhóm tương đồng với Tridacna sp. YCT2005 và có mối quan hệ gần gũi với T. maxima. Như vậy có thể thấy loài
Tridacna sp. là một biến dị di truyền của loài T. maxima.
Chỉ thị phân tử CO1 mtDNA cho thấy mối quan hệ rõ ràng hơn giữa T. crocea và
T. squamosa. Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đó. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy T. crocea và T. squamosa có mối quan hệ gần gũi với T. maxima, T. gigas và Tridacna sp;loài T. derasa có vị trí phân bố không xác định trên cây phân loại. Kết quả này có sự sai khác với các báo cáo trước đó của Maruyama và cộng sự (1998), Schneider và O'Foighil (1999) và Benzie và Williams (1998) khi sử dụng chỉ thị phân tử là16S rDNA, 18S rRNA và phân tích protein [47, 56, 23]. Theo các tác giả thì T. gigas và T. derasa lập thành một nhóm đồng dạng và có mối quan hệ gần gũi với (T. crocea và T. squamosa). Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng tôi
lại phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nuryanto và cộng sự (2007) sử dụng chỉ thị phân tử CO1 mtDNA. Theo như báo cáo của Nuryanto, cây phát sinh loài sử dụng thuật toán NJ và MP chỉ ra rằng bốn loài T. crocea, T. maxima, T. squamosa và T. gigas lập thành một nhóm đồng dạng. Trong nhóm này, (T. crocea + T. squamosa) lập thành một nhóm và có mối quan hệ gần gũi với T. maxima và T. gigas, mặc dù chúng