a. Tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự
Tách chiết DNA
Các trình tự DNA được tách chiết từ mẫu mô màng áo của từng cá thể trai tai tượng (thu trực tiếp ngoài biển, giữ trong nitơ lỏng, sau đó được bảo quản ở -700
bằng bộ kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phần Phụ lục 1).
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
2 µL dung dịch tách chiết DNA được dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen 16S mtDNA (16S mitochondrial DNA), CO1 mtDNA (Cytochrome oxidase c subunit 1 mitochrondrial DNA). Trình tự các đoạn mồi được trình bày ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự các đoạn mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR
Gen Mồi xuôi Mồi ngƣợc Nguồn
16S mtDNA 16SF-5’-CCGGTCTG AACTCAGATCACGT-3’ 16SR-5’-GTTTACCAAAA ACATGGCTTC-3' Espiritu và cs, 2001 CO1 mtDNA CO1-Tricro-Frwd 5’GGGTGATAAT TCGAACAGAA-3’ CO1-Tricro-Rev 5’-TAGTTAAAGCC CCAGCTAAA-3’ Kochzius và cs, 2008 Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 50 µL gồm 2 µL khuôn DNA, 5 µL Dream Taq buffer 1X, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 0,5 µM mỗi mồi (10mM), 2 mM MgCl2 và 1 đơn vị Dream Taq polymerase (5U/1 µL) và nước cho đủ thể tích. Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-rad) theo chương trình nhiệt độ:
- Gen 16S mtDNA: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94o
C trong 40 giây, 47oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây, cuối cùng là bước kéo dài tại 72o
C trong 5 phút.
- Gen CO1 mtDNA: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94o
C trong 1 phút, 43oC trong 1 phút 30 giây, 72oC trong 1 phút, cuối cùng là bước kéo dài tại 72o
C trong 5 phút.
- Điện di kiểm tra kết quả:
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide.
Các bƣớc tiến hành:
- Chuẩn bị gel agarose 1,5%: Cho 0,6 g agarose vào 40 mL đệm TBE 0,5X, đem đun trên bếp cách thủy hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Hạn chế bay hơi nước khi đun để tránh tăng nồng độ agarose. Để nguội đến khoảng 60oC thì lấy 2 mL ethimidium bromide cho vào trộn đều với gel, sau đó đổ dung dịch agarose vào
khuôn gel điện di đã cài lược sẵn (khuôn 8 giếng). Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp. Sau 30 – 40 phút, khi gel đã đông cứng thì gỡ lược ra, cho vào máy điện di, đổ đệm TBE vào ngập khuôn cách mặt gel từ 1 – 2 mm.
- Tra mẫu DNA vào giếng điện di:
Lấy 8 µL sản phẩm PCR trộn chung với 2 µL thuốc nhuộm (Loading Buffer), sau đó tra vào giếng nhỏ trên gel.
Chạy điện di cũng với DNA chuẩn (Marker) để xác định kích thước phân tử DNA.
- Chạy điện di: Cho vào máy điện di với chương trình: U = 85 – 90V, I = 400 mA, trong thời gian từ 30 – 40 phút. Phân tử DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương.
- Quan sát và chụp hình:
Sau khi chạy xong (khi thấy vệt màu xanh cách giếng khoảng 3 cm) lấy khuôn ra khỏi máng và đặt gel lên bàn UV của máy Gel Doc (Bio-rad).
Xem các dải DNA dưới tia sáng của đèn cực tím. Kết quả sẽ được ghi nhận thông qua phần mềm Quantity One.
Giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) như hướng dẫn của nhà sản xuất. 1 – 2 µL sản phẩm PCR đã tinh sạch được tiến hành phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye – labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình nhiệt như sau: 96o
C trong 20s, 50oC trong 20s, cuối cùng là 60o
C trong 4 phút. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems).
b. Phân tích đa dạng loài trai tai tƣợng
Kết nối trình tự
Các trình tự trai tai tượng thu được sẽ được kết nối bằng kỹ thuật Contig Express trong phần mềm package Vector NTIv.9.
Sau đó, các trình tự đó sẽ được kiểm chứng bằng chương trình Blast Nucleotide trên webside của Ngân hàng Gen (ncbi.nlm.nih.gov/Blast/). Các trình tự được gióng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.0.1 [34] sử dụng tính năng Clustax và được kiểm tra lại và chỉnh sửa bằng mắt thường.
So sánh trình tự các loài trai tai tƣợng
Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự của các loài cần so sánh được tính toán theo công thức:
Phân tích đa dạng loài trai tai tƣợng Tridacna crocea dựa trên haplotype
Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể trai được tính bằng tổng số haplotype (k), số lượng vị trí đa hình – polymorphic sites (s), đa dạng haplotype – haplotype diversity (h) và đa dạng nucleotide (nucleotide diversity- Π), số đột biến (η).
- Tổng số hapotype:
Haplotype là một biến thể thứ tự duy nhất của một gen tại cùng một locus trong bộ gen. Các trình tự gen có cũng số điểm đột biến lập thành một haplotype. Các haplotype khác nhau bởi một điểm đột biến.
- Đa dạng haplotype: xác suất hai lựa chọn ngẫu nhiên các haplotype trong một mẫu là khác nhau (tương đương với dị hợp tử được mong đợi)
k i pi n n h 1 2 1 1
Trong đó: h là đa dạng haplotype
n là số lượng các haplotype trong một mẫu
p là tần số của từng haplotype trong mẫu
- Đa dạng nucleotide: là số lượng trung bình của các vị trí nucleotide khác nhau giữa hai chuỗi nucleotide được rút ra ngẫu nhiên từ một mẫu.
Cách tính: Số lượng trung bình của các vị trí nucleotide khác nhau giữa hai chuỗi được rút ra một cách ngẫu nhiên từ một mẫu:
∏ = (n/(n-1)) Σxi xj πij
Trong đó, xi, xj là tần số của các alen i và j; πij là tần suất sai khác giữa alen i và j; n là chiều dài của chuỗi nucleotide.
- Số đột biến:
Xác suất mà bất kỳ một vị trí xảy ra đột biến là:
Xác suất đột biến = số đột biến/tổng số nucleotide trong chuỗi/thế hệ Tổng số đột biến trên cả chiều dài chuỗi nucleotide là:
Sự khác biệt di truyền =
Số nucleotide khác biệt Tổng số nucleotide dóng hàng
η = xác suất đột biến * (tổng số nucleotide – số nucleotide đã bị đột biến)
c. Phân tích mối quan hệ loài Tridacna spp. và di truyền quần thể Tridacna crocea bằng cây tiến hóa (phylogenetic tree)
Phân tích mối quan hệ loài Tridacna spp.
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen 16S mtDNA và CO1 mtDNA của trai tai tượng thu tại Khánh Hòa và Côn Đảo, cụ thể như sau:
- Dữ liệu gen 16S mtDNA bao gồm 4 trình tự của 4 loài trai tai tượng trong nghiên cứu hiện tại và 11 trình tự gen từ Ngân hàng Gen.
- Dữ liệu gen CO1 mtDNA bao gồm 3 trình tự của các loài trai tai tượng trong nghiên cứu hiện tại và 7 trình tự gen từ Ngân hàng Gen.
Thông tin về các trình tự, mã số gen của các loài trai tai tượng được trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Trình tự gen 16S, CO1 mtDNA của các loài trai tai tƣợng Loài 16S mtDNA CO1 mtDNA Tài liệu tham khảo
H. hippopus AM909765.1 Kochzius và cs, 2007
H. porcellanus AF122974.1 Schneider và Foighil, 1999
T. costata AM909741.1 Kochzius và cs, 2007
T. crocea* EU341348.1 JN392066.1 DeBoer và cs, 2008; Neo và Todd, 2011
T. derasa AF122976.1 GQ166591.1 Schneider và O'Foighil, 1999; Plazzi và Passamonti, 2010
T. gigas AF122975.1 EU003616.1 Schneider và O'Foighil, 1999; Nuryanto và cs, 2008
T. maxima* AM909752.1 Kochzius và cs, 2008;
T sp. YCT-2005* DQ119339.1 DQ168140.2 Tang và Chen, 2005
T. squamosa* AM909760.1 EU003615.1 Nuryanto và cs, 2008; Plazzi và Passamonti, 2010
Acanthocardia
echinata** EU733105.1 EF528305.1 Kirkendale và cs, 2009 A. tuberculata** EU733168.1 Kirkendale và cs, 2009
(*) Loài có trong nghiên cứu hiện tại nhưng trình tự gen của nó chưa có mã số gen trên Ngân hàng Gen. (**) Loài có trình tự gen làm nhóm ngoại
Trình tự của hai loài Acanthocardia echinata và A. tuberculata từ Ngân hàng Gen được sử dụng làm nhóm ngoại trong tất cả các phân tích vì theo Plazzi và Passamont (2010) giống Acanthocardia có quan hệ gần gũi với giống Tridacna [52].
Phân tích cấu trúc di truyền quần thể loài Tridacna crocea
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp trình tự gen CO1 mtDNA của trai tai tượng T. crocea thu tại khu vực Khánh Hòa và Côn Đảo, bao gồm 58 trình tự trong nghiên cứu hiện tại và 42 trình tự từ Ngân hàng Gen. Trình tự của hai loài trai tai tượng T. maxima (EU346368) và T. squamosa (EU346361) từ Ngân hàng Gen được sử dụng làm nhóm ngoại [27]. Thông tin về các trình tự, mã số gen của T. crocea sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 5 phần phụ lục Bảng.
Phương pháp phân tích cây tiến hóa
Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa của trai tai tượng Tridacna spp. và đa dạng di truyền của loài T. crocea được tiến hành dựa trên 3 thuật toán Maximum parsimony (MP), Neighbor joining (NJ) và Bayesain inference (BI). Các phương pháp được phân tích bằng phần mềm PAUPv4.0 [58], MEGA 5.1 và MrBayes 3.1.2 [37].
Bảng 2.4. Thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa (best fit models) của phân tích đa dạng loài Tridacna spp. đƣợc lựa chọn bởi phần
mềm Modeltest 3.7, sử dụng tính năng Akaike Information Criterion
Thông số 16S mtDNA CO1 mtDNA
Tổng số trình tự
Tổng số Nucleotide gióng hàng Vị trí không đổi (Constant sites)
Vị trí không mang thông tin (Parsimony inunformative)
Vị trí mang thông tin (Parsimony informative)
Mô hình tiến hóa (Best fit model) Tần suất cân bằng Nucleotide
14 417 272 19 126 TVM+I+G 0,3078; 0.1560 9 499 294 53 152 K81uf+I+G 0,2612; 0,1583
(Nucleotide equilibrium frequency µ (A,C,G,T))
Phân bố gama (Gama distribution)
0,2537; 0.2825
0,4275
0,1842; 0,3963
0,14448
Đối với thuật toán MP và NJ, 1000 độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng. Trước khi tiến hành thuật toán BI, các mô hình tiến hóa đã được kiểm tra bằng phần mềm Modeltest 3.7 [53] và MrModeltest 2.2 [50]. Mô hình tối ưu và các thông số cơ bản của phân tích tiến hóa trai tai tượng và đa dạng di truyền T. crocea được trình bày ở Bảng 2.4 và Bảng 2.5. Riêng đối với thuật toán Neighbor joining, sử dụng mô hình tiến hóa Jukes – Cantor model để kiểm tra.
Bảng 2.5. Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa (best fit models) của phân tích di truyền quần thể loài Tridacna crocea đƣợc lựa chọn bởi phần mềm Modeltest 3.7, sử dụng tính năng Akaike Information Criterion
Thông số CO1 mtDNA
Tổng số trình tự
Tổng số Nucleotide gióng hàng Vị trí không đổi (Constant sites)
Vị trí không mang thông tin (Parsimony inunformative) Vị trí mang thông tin (Parsimony informative)
Mô hình tiến hóa (Best fit model)
Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide equilibrium frequency µ (A,C,G,T))
Phân bố gama (Gama distribution)
70 412 273 19 120 HKY+G 0,2658; 0,1787; 0,1822; 0,3733 0,3427
Đối với thuật toán BI, các mô hình thay thế được tính toán. Chương trình được chạy trên 4 kênh với 2 triệu thế hệ, với tần suất tính toán trên 100 thế hệ. Phân tích được lặp lại 2 lần để xác định độ chính xác của phương pháp phân tích. Giá trị tin cậy (posterior probability-PP) được biểu hiện trên các nhánh của cây tiến hóa [37].
Giá trị bootstrap (BT) được tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán MP và NJ với độ lặp lại 100. Do sự hạn hẹp về thời gian và số lượng trình tự quá lớn nên chúng tôi áp dụng phương pháp Successive approximation approach (Sullivan và cộng sự, 2005) để xác định cây tiến hóa dựa trên mô hình tiến hóa và so sánh kết quả
thu được với phương pháp phân tích MP, NJ và BI. Cây đa dạng loài được biểu hiện và hiệu chỉnh bằng phần mềm TreeView 1.6.6 [51].
Xây dựng mạng lưới haplotype – haplotype network
Việc xây dựng các lưới haplotype được sử dụng để trình bày sự liên kết giữa các haplotype. Đây là cách sắp xếp các haplotype thu được từ một mẫu nghiên cứu một cách tối ưu và đơn giản. Việc này không chỉ tiết kiệm thời gian mà còn thuận tiện trong việc xem xét mối quan hệ giữa các haplotype.
Để xây dựng mạng lưới haplotype, sử dụng phần mềm Network 4.6.1. Phần mềm này sử dụng kết nối mạng dữ liệu đầu vào được tạo ra phần mềm DnaSPv5 (hoặc được thêm vào từ một tập tin có sẵn) và sử dụng thuật toán Median Joining (chức năng Calculate Network) để tính, chức năng Draw network cho phép tự động vẽ ra mạng lưới giữa các haplotype được xem xét.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái phân loại của trai tai tƣợng
Sau thời gian thu thập và nghiên cứu đặc điểm hình thái của trai tai tượng
Tridacna spp. ở các khu vực nghiên cứu (Khánh Hòa và Côn Đảo), chúng tôi đã tiến hành phân loại được 4 loài trai tai tượng có ở các khu vực này. Một số chỉ tiêu phân loại của chúng được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu phân loại của trai tai tƣợng (Tridacna spp.) Chỉ tiêu Tridacna crocea (n = 64) Tridacna maxima (n = 6) Tridacna sp. (n = 2) Tridacna squamosa (n = 3) Chiều dài (cm) 4,2 – 12,0 8,3 ± 1,80 10,0 – 15,0 11,5 ± 1,87 4,9 – 17 11,0 ± 8,55 16,0 – 22,0 18,5 ± 3,12 Chiều rộng (cm) 1,7 – 5,3 3,85 ± 0,88 4,2 – 6,5 5,1 ± 0,83 2,3 – 8,0 5,2 ± 4,03 8,5 – 11,0 10,0 ± 1,34 Chiều cao (cm) 1,2 – 7,8 5,6 ± 1,40 5,3 – 8,5 6,4 ± 1,13 3,6 – 7,0 5,3 ± 2,40 1,2 – 10,8 11,5 ± 3,06 Chiều dài bản lề (cm) 1,5 – 5,0 3,3 ± 0,91 3,5 – 4,5 3,8 ± 0,41 2,2 – 8,0 5,1 ± 4,10 6,5 – 12 8,6 ± 2,95 Chiều dài lỗ tơ chân (cm) 1,6 – 5,0 3,9 ± 0,88 3,0 – 4,5 3,5 ± 0,57 3,0 – 6,0 4,5 ± 2,12 3,0 – 4,0 3,7 ± 0,58 Chiều rộng lỗ tơ chân (cm) 0,8 – 2,6 1,7 ± 0,41 1,5 – 2,0 1,7 ± 0,19 1,3 – 2,5 1,9 ± 0,85 1,9 – 2,0 2,0 ± 0,06 Khối lượng (g) 10,0 – 330,0 142,2 ± 75,90 160,0 – 760,0 305,0 ± 231,41 28,1 – 550 289,0 ± 369,10 700,0 – 1700,0 1050,0 ± 60, 31
Số liệu được trình bày dưới dạng: hàng trên là khoảng dao động của giá trị, hàng dưới là giá trình trung bình ± độ lệch chuẩn.
Tridacna squamosa Roding, 1798
Tên tiếng Anh: Scaly giant clam Tên tiếng Việt: Trai tai tượng vảy
Khu vực thu mẫu: Vịnh Nha Trang (Khánh Hòa) Thời gian: Từ tháng 5/2011 – 12/2011
- Phân bố:
Những cá thể trai tai tượng T. squamosa được tìm thấy trong các khu vực rạn san hô. Chúng được tìm thấy ở độ sâu từ 15 – 18 m, thường ở giữa các loài san hô sống.
Trên thế giới, loài này phân bố ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương. Ngoài ra, các báo cáo trước đó còn cho thấy khu vực phân bố của loài có thể phía Đông Châu Phi cho tới Polynesia (Pháp) [44, 46, 54].
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái vỏ của Tridacna squamosa
a. mặt lưng, b. mặt bên, c. mặt bụng
- Đặc điểm hình thái
Trai tai tượng Tridacna squamosa là loài có kích thước trung bình so với các loài khác thuộc họ Tridacnidae. Chiều dài vỏ đạt từ 16 – 22 cm (trung bình 18,5 cm), tỷ lệ về độ dài giữa chiều rộng và chiều cao xấp xỉ bằng 1:1; chiều dài lớn gấp 1,7 – 2 lần chiều cao. Loài này có khối lượng lớn nhất so với các loài thu thập được trong nghiên cứu hiện tại. Khối lượng dao động từ 700 – 1700 g (trung bình đạt 1050 g). Khối lượng này tùy thuộc vào từng giai đoạn sinh trưởng của các cá thể (Bảng 3.1).
Màu sắc vỏ đa dạng, có màu trắng được pha lẫn với màu xanh lá cây ở bản lề; hay có màu vàng pha lẫn với màu cam ở giữa các rãnh; hoặc đơn giản chỉ là màu vàng hoặc màu cam (Hình 3.1).
Vỏ đều nhau, trên bề mặt vỏ có các vảy lớn tạo thành các rãnh sâu, có dạng hình máng. Trong tự nhiên, các vẩy lớn trên vỏ trai đã tạo ra nơi ẩn nấp cho các loài động vật nhỏ như cua, trai, hay các động vật không xương sống khác [46]. Tỷ lệ giữa chiều dài của bản lề và chiều dài vỏ đạt 0,46. Trai tai tượng T. squamosa là loài có bản lề dài
a
b
nhất so các loài có trong nghiên cứu hiện tại. Vỏ có lỗ tơ chân với kích thước nhỏ. Chiều dài lỗ tơ chân bằng 0,4 chiều rộng vỏ và bằng 0,2 chiều dài vỏ. Chiều rộng lỗ tơ chân đạt khoảng 2 cm (Bảng 3.1). Điều này phù hợp với tập tính sống của loài. Trai tai tượng T. squamosa hầu như ít sử dụng tơ chân của nó để bám vào vật bám, chúng giữ cơ thể ổn định trong môi trường nước dựa vào trọng lượng của cơ thể [30].