Trai tai tượng là một trong những nguồn lợi hải đặc sản thuộc lớp động vật thân mềm hai mảnh vỏ và có giá trị kinh tế ở Việt Nam. Thịt có hàm lượng dinh dưỡng cao, vỏ là hàng mỹ nghệ. Chúng cung cấp nguồn thức ăn bổ dưỡng và là nguồn sản phẩm xuất khẩu mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho ngư dân ven biển – đảo [9].
Cho đến nay, tại Việt Nam đã phát hiện và thống kê được tổng số 5 loài trai tai tượng thuộc họ Tridacnidae (trong tổng số 9 loài trên thế giới): Tridacna gigas, T. squamosa, T. maxima, T. crocea và Hippopus hippopus [11]. Cả 5 loài này phân bố chủ yếu ven biển miền Trung và ven các đảo phía Nam (Phú Quốc, Phú Quý, Côn Đảo) từ vùng hạ triều đến độ sâu khoảng 20m, trên các nền đáy đá hoặc các rạn san hô [9]. Ngoài ra, một số nhà khoa học cho rằng vùng biển Việt Nam có thêm cả loài T. derasa, tuy nhiên cần có những nghiên cứu phân loại dựa trên đặc điểm di truyền để có thể xác định rõ ràng hơn về loài này [14].
Theo tài liệu trích dẫn trong Sách Đỏ Việt Nam (2000), tại Việt Nam 2 loài trai tai tượng T. gigas, H. hippopus phân bố chủ yếu ở quần đảo Trường Sa. Trong đó, loài trai tai tượng khổng lồ (T.gigas) là loài trai lớn nhất trong lớp động vật thân mềm hai mảnh vỏ. Đây là loài quý hiếm, có không gian phân bố hẹp, trữ lượng ngoài tự nhiên rất ít, mức đe dọa bậc R [3].
Ngoài ra, 2 loài trai tai tượng là T. crocea và T. maxima được ghi nhận có phân bố rải rác một số đảo ven biển miền Trung và phía Nam, đặc biệt loài T. crocea được tìm thấy nhiều ở Côn Đảo [9]. Trai tai tượng vẩy T. squamosa được ghi nhận là loài phân bố khá phổ biến ở biển Việt Nam, phân bố trên các rạn san hô từ Phú Yên, Khánh Hòa, Bình Thuận cho đến Trường Sa, Phú Quý và Phú Quốc [16].
Trong những năm gần đây, nguồn lợi trai tai tượng ở Việt Nam đang bị khai thác quá mức khiến cho nguồn lợi này giảm sút nhanh chóng, có nguy cơ cạn kiệt. Vì vậy, để duy trì nguồn gen quý hiếm của trai tai tượng, tạo điều kiện thuận lợi cho chúng sinh trưởng, phát dục, phát tán nguồn con giống trên các rạn san hô ở Côn Đảo, phòng Khoa học và Giáo dục Môi Trường – Vườn Quốc Gia Côn Đảo đã thực hiện công tác khảo sát và di dời trai tai tượng từ các khu vực phân bố xa trung tâm quản lý về khoang nuôi bảo vệ tại vịnh Đầm Tre gần trạm Kiểm Lâm từ năm 2005 – 2007. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho trai tai tượng sinh trưởng và phát triển, phục vụ cho bảo tồn, nghiên cứu khoa học và tham quan du lịch.
Năm 2006, Bùi Như Lai nghiên cứu nguồn lợi, đặc điểm sinh học, thử nghiệm sinh sản nhân tạo, đề xuất giải pháp bảo vệ, phát triển nguồn lợi trai tai tượng tại Côn Đảo, Bà Rịa – Vũng Tàu và bước đầu đã đánh giá được sơ bộ về thành phần loài, nguồn lợi trai tai tượng tại một số đảo nhỏ thuộc Vườn Quốc Gia Côn Đảo [9]. Ngoài ra năm 2010, Viện Nghiên cứu Hải sản đã triển khai đề tài “Nghiên cứu phục hồi và phát triển nguồn lợi trai tai tượng (họ Tridacnidae) ở biển Việt Nam” [9]. Tuy nhiên, cho đến nay kết quả nghiên cứu vẫn còn nhiều hạn chế, mới chỉ dừng ở quy mô thử nghiệm và chưa được áp dụng vào điều kiện thực tế.
Đồng thời, tại Việt Nam cho tới nay vẫn có rất ít các nghiên cứu, điều tra tổng thể về trai tai tượng, do đó các dữ liệu về hình thái, cấu trúc quần đàn và đặc điểm di truyền của các loài trai tai tượng gần như đang bị bỏ ngỏ. Với tốc độ khai thác như hiện nay, nguồn lợi loài hải sản này đang bị suy giảm nghiêm trọng. Vì vậy, các nghiên cứu chuyên sâu về trữ lượng, phân bố, đa dạng di truyền làm cơ sở cho công tác bảo tồn sinh vật biển là rất cấp thiết.
CHƢƠNG 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm, thời gian và đối tƣợng nghiên cứu
- Địa điểm thực hiện:
Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại học Nha Trang
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 5/2011 đến tháng 5/2012
- Đối tượng nghiên cứu:
Các loài trai tai tượng (Tridacna spp.) được thu tại vịnh Nha Trang và vịnh Vân Phong (tỉnh Khánh Hòa) và Côn Đảo (tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu) từ tháng 5 – 12 năm 2011.
Đối tượng cho nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa bao gồm: Tridacna crocea, T. squamosa, T. maxima và Tridacna sp.
Các loài trai tai tượng sau khi thu sẽ được phân loại sơ bộ, đo kích thước, khối lượng, chụp ảnh và được giữ trong nitơ lỏng, sau đó được vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm, lưu giữ ở -70oC cho các phân tích chi tiết về hình thái và di truyền.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Các bước tiến hành nghiên cứu hình thái và di truyền của trai tai tượng được thực hiện theo sơ đồ Hình 2.1.
2.2.1. Phương pháp định danh phân loại trai tai tượng
Phân tích đặc điểm hình thái
Tất cả các mẫu cá thể trai tai tượng thu được đều được sử dụng làm mẫu nghiên cứu. Trai tai tượng được rửa bằng nước sạch, đặt lên khay đá để ráo nước. Dùng thước có chia độ đo (cm và mm) để đo các kích thước của vỏ trai (Hình 2.2).
- Chiều dài vỏ được đo từ mép vỏ mặt sau đến mép vỏ mặt trước.
- Chiều cao vỏ đo từ mép vỏ phía mặt lưng đến đỉnh vỏ phía mặt bụng.
- Chiều rộng vỏ là khoảng rộng nhất giữa hai vỏ khi chúng khép chặt.
- Chiều dài bản lề đo từ đỉnh vỏ đến mép vỏ, nơi hai mảnh vỏ đóng mở.
- Chiều dài lỗ tơ chân đo từ đỉnh vỏ đến hết chiều dài lỗ tơ chân.
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu hình thái và đa dạng di truyền trai tai tƣợng
Phân tích đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể
Giải trình tự gen
Khuếch đại gen 16S và CO1 mt DNA Tách chiết DNA
Nghiên cứu hình thái Mẫu trai tai tượng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Điện di - Đo kích thước, cân khối lượng
- Quan sát màu sắc, hoa văn màng áo
Bộ kit WIZARD SV Genomic DNA Purification (Promega)
Cặp mồi 16S, CO1- Tricro 90v 30 – 40 phút Máy ABI Prism 3700 DNA Analyser Phân tích MP/NJ/BI
Hình 2.2. Đo kích thƣớc của trai tai tƣợng
LV chiều dài vỏ,WV chiều rộng vỏ, HV chiều cao vỏ, LBL chiều dài bản lề, LLTC chiều dài lỗ tơ chân, WLTC chiều rộng lỗ tơ chân
Sau đó, dùng cân kỹ thuật để cân khối lượng từng mẫu. Chụp ảnh và quan sát hình dạng bên ngoài của vỏ trai tai tượng (Hình 2.3).
Hình 2.3. Hình dạng ngoài của trai tai tƣợng
(Nguồn: Fatherree, 2008)
Đồng thời, tiến hành quan sát màng áo của các cá thể trai tai tượng thu được để xác định màu sắc, hoa văn của màng áo (Hình 2.4 và 2.5)
LV LBL WV WLT C LLTC HV Nếp gấp Đỉnh vỏ Vẩy Đường bản lề Bản lề Mép vỏ Lỗ tơ chân
Hình 2.4. Quan sát màng áo của trai tai tƣợng từ mặt lƣng
(Theo Animal-World, 2009)
1 ống hút nước, 2 ống thoát nước, 3 màng áo
Hình 2.5. Quan sát mặt bên màng áo của trai tai tƣợng
1 màng áo, 2 mặt bên màng áo, 3 cơ co rút tơ chân, 4 cơ khép vỏ, 5 chân
Màu sắc và cấu tạo màng áo của trai tai tượng được mô tả sơ bộ trong Bảng 2.1.
1 2 4 3 5 2 3 1
Bảng 2.1. So sánh giải phẫu học màng áo của các loài trai tai tƣợng
Loài Màu sắc/cấu tạo Xúc tu miệng
T. gigas
Màu nâu; có các vòng tròn màu xanh xung quanh những bộ phận trong suốt kéo dài đến mép màng áo
Không có
T. derasa Màng áo kéo dài ra, có màu sắc rực rỡ như xanh da trời, nâu, xanh lá
Độ dài trung bình, hẹp, phân nhánh
T. squamosa Có những chấm lốm đốm với nhiều màu xanh lá, xanh da trời, nâu, da cam và vàng
Ngắn, cùn, phân nhánh
T. maxima Thường có màu sáng, đa dạng Ngắn, cùn, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phân nhánh
T. crocea Thường có màu sáng: xanh lá, xanh da trời, tía, nâu và da cam
Ngắn, cùn, phân nhánh
T. tevoroa Nâu, xám, xanh lá, màng áo nhăn nheo với nhiều hột giống mụn cơm
Dài, rộng và không phân nhánh
H. hippopus Vàng – nâu, các màu tối, với các đường xanh lá
hoặc xám, mờ Không có
H. porcellanus Vàng – nâu, các màu tối, với các đường xanh lá
hoặc xám, mờ
Dài trung bình, rộng, phân nhánh
(Theo Norton và Jones, 1992)
Trai tai tượng được định danh dựa vào đặc điểm hình thái theo Rosewater (1965, 1982) [54, 55] và Lucas (1988) [44].
Dựa theo giải trình tự DNA
Các loài trai tai tượng cũng được định danh dựa trên việc giải trình tự DNA của gen 16S và CO1 mtDNA.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu di truyền trai tai tượng
a. Tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự
Tách chiết DNA
Các trình tự DNA được tách chiết từ mẫu mô màng áo của từng cá thể trai tai tượng (thu trực tiếp ngoài biển, giữ trong nitơ lỏng, sau đó được bảo quản ở -700
bằng bộ kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phần Phụ lục 1).
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
2 µL dung dịch tách chiết DNA được dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen 16S mtDNA (16S mitochondrial DNA), CO1 mtDNA (Cytochrome oxidase c subunit 1 mitochrondrial DNA). Trình tự các đoạn mồi được trình bày ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự các đoạn mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR
Gen Mồi xuôi Mồi ngƣợc Nguồn
16S mtDNA 16SF-5’-CCGGTCTG AACTCAGATCACGT-3’ 16SR-5’-GTTTACCAAAA ACATGGCTTC-3' Espiritu và cs, 2001 CO1 mtDNA CO1-Tricro-Frwd 5’GGGTGATAAT TCGAACAGAA-3’ CO1-Tricro-Rev 5’-TAGTTAAAGCC CCAGCTAAA-3’ Kochzius và cs, 2008 Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 50 µL gồm 2 µL khuôn DNA, 5 µL Dream Taq buffer 1X, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 0,5 µM mỗi mồi (10mM), 2 mM MgCl2 và 1 đơn vị Dream Taq polymerase (5U/1 µL) và nước cho đủ thể tích. Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-rad) theo chương trình nhiệt độ:
- Gen 16S mtDNA: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94o
C trong 40 giây, 47oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây, cuối cùng là bước kéo dài tại 72o
C trong 5 phút.
- Gen CO1 mtDNA: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94o
C trong 1 phút, 43oC trong 1 phút 30 giây, 72oC trong 1 phút, cuối cùng là bước kéo dài tại 72o
C trong 5 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Điện di kiểm tra kết quả:
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide.
Các bƣớc tiến hành:
- Chuẩn bị gel agarose 1,5%: Cho 0,6 g agarose vào 40 mL đệm TBE 0,5X, đem đun trên bếp cách thủy hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Hạn chế bay hơi nước khi đun để tránh tăng nồng độ agarose. Để nguội đến khoảng 60oC thì lấy 2 mL ethimidium bromide cho vào trộn đều với gel, sau đó đổ dung dịch agarose vào
khuôn gel điện di đã cài lược sẵn (khuôn 8 giếng). Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp. Sau 30 – 40 phút, khi gel đã đông cứng thì gỡ lược ra, cho vào máy điện di, đổ đệm TBE vào ngập khuôn cách mặt gel từ 1 – 2 mm.
- Tra mẫu DNA vào giếng điện di:
Lấy 8 µL sản phẩm PCR trộn chung với 2 µL thuốc nhuộm (Loading Buffer), sau đó tra vào giếng nhỏ trên gel.
Chạy điện di cũng với DNA chuẩn (Marker) để xác định kích thước phân tử DNA.
- Chạy điện di: Cho vào máy điện di với chương trình: U = 85 – 90V, I = 400 mA, trong thời gian từ 30 – 40 phút. Phân tử DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương.
- Quan sát và chụp hình:
Sau khi chạy xong (khi thấy vệt màu xanh cách giếng khoảng 3 cm) lấy khuôn ra khỏi máng và đặt gel lên bàn UV của máy Gel Doc (Bio-rad).
Xem các dải DNA dưới tia sáng của đèn cực tím. Kết quả sẽ được ghi nhận thông qua phần mềm Quantity One.
Giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) như hướng dẫn của nhà sản xuất. 1 – 2 µL sản phẩm PCR đã tinh sạch được tiến hành phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye – labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình nhiệt như sau: 96o
C trong 20s, 50oC trong 20s, cuối cùng là 60o
C trong 4 phút. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems).
b. Phân tích đa dạng loài trai tai tƣợng
Kết nối trình tự
Các trình tự trai tai tượng thu được sẽ được kết nối bằng kỹ thuật Contig Express trong phần mềm package Vector NTIv.9.
Sau đó, các trình tự đó sẽ được kiểm chứng bằng chương trình Blast Nucleotide trên webside của Ngân hàng Gen (ncbi.nlm.nih.gov/Blast/). Các trình tự được gióng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.0.1 [34] sử dụng tính năng Clustax và được kiểm tra lại và chỉnh sửa bằng mắt thường.
So sánh trình tự các loài trai tai tƣợng
Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự của các loài cần so sánh được tính toán theo công thức:
Phân tích đa dạng loài trai tai tƣợng Tridacna crocea dựa trên haplotype
Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể trai được tính bằng tổng số haplotype (k), số lượng vị trí đa hình – polymorphic sites (s), đa dạng haplotype – haplotype diversity (h) và đa dạng nucleotide (nucleotide diversity- Π), số đột biến (η).
- Tổng số hapotype:
Haplotype là một biến thể thứ tự duy nhất của một gen tại cùng một locus trong bộ gen. Các trình tự gen có cũng số điểm đột biến lập thành một haplotype. Các haplotype khác nhau bởi một điểm đột biến.
- Đa dạng haplotype: xác suất hai lựa chọn ngẫu nhiên các haplotype trong một mẫu là khác nhau (tương đương với dị hợp tử được mong đợi)
k i pi n n h 1 2 1 1
Trong đó: h là đa dạng haplotype
n là số lượng các haplotype trong một mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
p là tần số của từng haplotype trong mẫu
- Đa dạng nucleotide: là số lượng trung bình của các vị trí nucleotide khác nhau giữa hai chuỗi nucleotide được rút ra ngẫu nhiên từ một mẫu.
Cách tính: Số lượng trung bình của các vị trí nucleotide khác nhau giữa hai chuỗi được rút ra một cách ngẫu nhiên từ một mẫu:
∏ = (n/(n-1)) Σxi xj πij
Trong đó, xi, xj là tần số của các alen i và j; πij là tần suất sai khác giữa alen i và j; n là chiều dài của chuỗi nucleotide.
- Số đột biến:
Xác suất mà bất kỳ một vị trí xảy ra đột biến là:
Xác suất đột biến = số đột biến/tổng số nucleotide trong chuỗi/thế hệ Tổng số đột biến trên cả chiều dài chuỗi nucleotide là:
Sự khác biệt di truyền =
Số nucleotide khác biệt Tổng số nucleotide dóng hàng
η = xác suất đột biến * (tổng số nucleotide – số nucleotide đã bị đột biến)
c. Phân tích mối quan hệ loài Tridacna spp. và di truyền quần thể Tridacna crocea bằng cây tiến hóa (phylogenetic tree)
Phân tích mối quan hệ loài Tridacna spp.
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen 16S mtDNA và CO1 mtDNA của trai tai tượng thu tại Khánh Hòa và Côn Đảo, cụ thể như sau:
- Dữ liệu gen 16S mtDNA bao gồm 4 trình tự của 4 loài trai tai tượng trong nghiên cứu hiện tại và 11 trình tự gen từ Ngân hàng Gen.
- Dữ liệu gen CO1 mtDNA bao gồm 3 trình tự của các loài trai tai tượng trong nghiên cứu hiện tại và 7 trình tự gen từ Ngân hàng Gen.
Thông tin về các trình tự, mã số gen của các loài trai tai tượng được trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Trình tự gen 16S, CO1 mtDNA của các loài trai tai tƣợng Loài 16S mtDNA CO1 mtDNA Tài liệu tham khảo
H. hippopus AM909765.1 Kochzius và cs, 2007
H. porcellanus AF122974.1 Schneider và Foighil, 1999
T. costata AM909741.1 Kochzius và cs, 2007
T. crocea* EU341348.1 JN392066.1 DeBoer và cs, 2008; Neo và Todd, 2011
T. derasa AF122976.1 GQ166591.1 Schneider và O'Foighil, 1999; Plazzi và Passamonti, 2010
T. gigas AF122975.1 EU003616.1 Schneider và O'Foighil, 1999;