Chƣơng II : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.2Phản ứng PCR (Polymerase Chain
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.2Phản ứng PCR (Polymerase Chain
a) Mục đích:
Nhân lên đoạn gen mong muốn (gen cytochrome b mitochondrial DNA) với số lượng nhiều.
b) Nguyên lý phản ứng
Phương pháp PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985.
Về nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ: Đầu tiên là giai đoạn biến tính ở 91oC-97oC làm biến tính mẫu DNA kép thành các chuỗi đơn; tiếp đến là giai đoạn bắt cặp mồi nhiệt độ ở 55oC-65oC, các đoạn mồi oligonucleotide ngắn gắn với các chuỗi DNA đơn; cuối cùng là kéo dài ở 68oC- 73oC, enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.
Như vậy, số lượng các bản DNA sao chép tăng lên gấp đơi ở mỗi chu kì. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Theo lý thuyết, kết quả sau n chu kì của phản ứng sẽ có 2n bản sao phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi.
c) Thiết kế mồi cho phản ứng PCR:
Trong nghiên cứu này sử dụng 2 cặp mồi Cytb FW1_Cytb RV1 và Cytb FW1_Cytb RV2 được thiết kế dựa trên tham khảo của cặp mồi ND5_Thr để nhân lên đoạn gen Cytb mtDNA chim yến (Bảng 2.2).
Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen Cytb của mtDNA
- Phương pháp đánh giá mồi:
Các thông số của mồi được kiểm tra bằng các phần mềm Oligo Analyzer, ClustalX 2.0.12, chương trình BLAST trên NCBI, cùng các trình tự bộ gen A. fuciphagus được lấy từ Genebank, cặp mồi sẽ được kiểm tra trên lý thuyết nhằm
đảm bảo các yêu cầu về kích thước, % GC, nhiệt độ biến tính, khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi, trước khi được ứng dụng vào thực nghiệm.
- Phương pháp xác định nồng độ mồi tối ưu:
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng PCR trên DNA được tách chiết từ mẫu cơ, sau đó sẽ áp dụng cho mẫu DNA tách chiết từ mẫu lông. Để xác định độ nhạy của mồi, chúng tôi tiến hành khảo sát ở các nồng độ mồi (10µM/l) khác nhau từ 0,25µl; 0,5µl; 0,75µl; 1µl; 1,25µl; 1,5µl với các điều kiện khác của phản ứng vẫn giữ nguyên. Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích 50µl gồm: 1µl khn DNA, 5µl 10X Dream Taq Buffer, 0,25mM mỗi loại dNTP, 2mM MgCl2, 1 đơn vị Taq polymerase (5U/1µl), nồng độ mồi được thay đổi như trên và nước cho đủ thể tích.
- Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi (Ta)
Từ nhiệt độ biến tính của mồi xi và mồi ngược được sử dụng, tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho phản ứng theo công thức:
Gen Mồi xuôi Mồi ngƣợc
Cytb mtDNA Cytb FW1: 5’GGGGGATTCTCAGT AGACAA 3’ Tm: 53,5oC Trọng lượng phân tử (MW): 6206.1g/mole 6.4 OD260 = 31.1 nMoles Cytb RV1: 5’AGGTTGGCTACT AGGTT 3’ Tm: 53,6oC; Trọng lượng phân tử: 5585.7 g/mole 7.2OD260=39.6nMoles Cytb RV2: 5’TCTTTGGTTTAC AAACCAAT 3’ Tm: 53,1oC Trọng lượng phân tử: 6395.2 g/mole 6.3OD260=27,5nMoles
Nguồn Thomassen, H.A và CS. [74] Tự thiết kế Desjardins và Morais cùng CS, 1990 [16], [48]
Ta = (Tm primer F + Tm primer R)/ 2±5oC
Ta (annealing temperature) là nhiệt độ cho phép mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn mẫu. Ta thường chênh lệch 5 – 10oC so với Tm (melting temperature). Tm cịn được gọi là nhiệt độ nóng chảy của DNA, là nhiệt độ mà tại đó một nửa số liên kết hydro nối hai mạch DNA bị phá vỡ. Mỗi mồi đều có Tm riêng tùy thuộc vào thành phần và số lượng nucleotide tạo thành mồi đó. Tương tự, mỗi mồi cũng có khoảng nhiệt độ mà ở đó chúng bắt cặp tốt nhất và đặc hiệu nhất với mạch khn. Do đó, để phản ứng PCR đạt hiệu quả cao cần chọn Ta gần Tm để mồi bắt cặp bổ sung hồn tồn với mạch khn chứa đoạn DNA cần khuếch đại và sau phản ứng PCR chỉ thu nhận sản phẩm khuếch đại mong muốn và khơng có vạch kí sinh nào.
Do đó, để xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2 ở các mức nhiệt độ từ 51oC, 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC và 57oC. Trừ sự thay đổi về nhiệt độ lai, các thành phần khác và các điều kiện của phản ứng đều khơng đổi. Phản ứng được chạy trên chương trình gradient nhiệt độ được thiết lập trên máy PCR. Sau đó tiến hành phân tích kết quả để tìm ra nhiệt độ lai tối ưu nhất cho cả quy trình.
- Xác định nồng độ DNA khuôn đối với các mẫu DNA tách chiết từ lông chim yến.
Chúng tôi tiến hành khảo sát các nồng độ DNA tách chiết từ mẫu lông chim yến khác nhau từ 4µl; 6µl; 8µl; 10µl; 12µl; 14µl. Ứng với mỗi nồng độ trên sẽ được khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được xác định từ các thí nghiệm trên.
d) Phƣơng pháp tiến hành
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 50µl gồm: 1µl khn DNA đối với DNA tách chiết từ mẫu cơ hoặc 10µl khn DNA đối với DNA tách chiết từ mẫu lơng, 5µl 10X Dream Taq Buffer, 0,25mM mỗi loại dNTP, 2µM mỗi mồi (10mM), 2mM MgCl2, 1 đơn vị Taq polymerase (5U/1µl) và nước cho đủ thể tích.
Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-Rad) theo chu trình nhiệt độ: biến tính ban đầu tại 95oC trong 3 phút; sau đó là 35 chu kỳ của 95oC trong 30 giây, 54oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút; cuối cùng là bước kéo dài
72oC trong 15 phút. Sau khi chạy PCR xong nếu chưa lấy mẫu ngay thì có thể cài đặt máy ở chế độ bảo quản mẫu 20oC (Hình 2.2).
Hình 2.2 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR 2.2.2.3 Điện di gel agarose 2.2.2.3 Điện di gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 1,5%: Lấy 0,6 gram agarose vào 40ml đệm SB 1X chứa trong bình tam giác 100ml. Đun sơi cách thủy cho đến khi gel tan hoàn toàn, để nguội đến nhiệt độ khoảng 60oC-70oC. Thêm 2µl ethidium bromide 10mg/ml vào bình, lắc nhẹ tránh tạo bọt để trộn đều ethidium bromide vào gel (hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi thao tác). Đổ gel ra khuôn đã sắp sẵn lược, độ dày của khn khơng ít hơn 0,8cm. Khi gel nguội hồn tồn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra.
Chạy điện di: Cho gel vào bồn điện di và thêm đệm SB 1X cho đến khi ngập bản gel. Trộn đều 3µl mẫu với 2µl loading dye 6X tra vào các giếng. Hút 3µl DNA Ladder (thang DNA) vào 1 giếng. Tiến hành chạy điện di với nguồn 80V trong 20-30 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đọc kết quả: Sau khi chạy xong, lấy gel đặt lên bàn UV của máy Gel Doc (Bio Rad). Xem các thang DNA dưới tia sáng của đèn cực tím
2.2.2.4 Giải trình tự
a) Nguyên tắc:
Giải trình tự của gen là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide, đó là A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine) trên phân tử DNA.
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này được xác định rõ. Chuyển các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vikhuẩn để nhân bản các vector thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng giới hạn các nucleotide tận (ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, G, C), phản ứng được thực hiện trong 4 ống và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, enzyme DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc.
Để thực hiện giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer) thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chum tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA cần giải trình tự.
b) Tiến hành:
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ “Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem” của Promega theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye® Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi Cytb FW1, Cytb RV1 và Cytb RV2 tương tự như phản ứng PCR, theo chương trình nhiệt như sau: 96oC trong 20 giây, 50oC trong 20 giây và 60oC trong 4 phút.
Sản phẩm phản ứng được phân tích trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism® 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems). Các trình tự được kết nối bằng kỹ thuật Contig Express trong phần mềm package Vector NTI v.9.
2.2.2.5 Xử lý số liệu xây dựng cây phát sinh lồi
a) Phân tích sự đa dạng của chim yến:
Trình tự cho mỗi locus liên kết, chỉnh sửa, và loại bỏ đi đoạn mồi để có chiều dài chung bằng cách sử dụng phần mềm lắp ráp trình tự DNA và phân tích GENEIOUS PRO 5.5 [19]. Trình tự đã được xử lý sẽ được nhập vào BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng [77].
b) Phân tích đa dạng di truyền chim yến (swiftlets) dựa trên haplotype:
Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể được tính bằng tổng số haplotype (k), số lượng của vị trí đa hình – polymorphic sites (s), đa dạng haplotype – haplotype diversity (d) và đa dạng nucleotide – nucleotide diversity ( số đột biến (Eta).
c) So sánh trình tự của chim yến
Sự khác biệt di truyền giữa các cặp trình tự của các lồi cần so sánh được tính tốn theo cơng thức:
d) Phân tích mối quan hệ phát sinh lồi (phylogenetic analysis):
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen Cytb mtDNA của chim yến thu tại Nha Trang, Đồng Nai từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2012 bao
gồm: 65 trình tự, trong đó có 20 trình tự từ nghiên cứu hiện tại (11 trình tự từ yến đảo, 8 trình tự từ yến nhà ở Khánh Hịa và 1 trình tự từ Đồng Nai) và 45 trình tự từ Genbank.
Thơng tin về các trình tự, mã số gen của các lồi chim yến được trình bày ở bảng 2.3. Trình tự của 2 lồi chim yến Apus apus (JQ353928) và Amazilia tzacatl (U89180) từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại trong tấc cả các phân tích [43], [62].
Bảng 2.3: Trình tự gen Cytb mtDNA của chim yến sử dụng trong nghiên cứu này
Loài Mã số gen Nơi thu mẫu Tài liệu tham khảo
A. salangana AY294424 USA Price và CS, 2004
A. elaphrus AY294430 USA Price và CS, 2004
A. francicus AY294433 USA Price và CS, 2004
Hydrochous gigas AY135625 Hà Lan Thomassen và CS, 2003
A. fuciphagus AY135631 AY135632 Hà Lan Thomassen và CS, 2003 A. fuciphagus EU072052 EU072054 EU072055 EU072061 EU072064 EU085131 EU085129 EU085127
EU085125 EU085123 A. fuciphagus JF269226 JF269227 JF2 69228 JF269229 JF2 69230 JF269231 JF2 69232 JF269233 JF269234 JF269236 Malaysia và Sumatra Goh và CS, 2011 A. fuciphagus HM626165
HM626164 Trung Quốc Chow và CS, 2010 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A. fuciphagus
Xxx (20
trình tự) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại
A. f. germani
JN709907
JN709908 JN709909
JN709910 JN709912 JN709914 JN709916 JN709918 JN709920 A. maximus JQ353846 JQ353847 Đức Packert và CS, 2012 A. brevirostris JQ353850 JQ353848 Đức Packert và CS, 2012 A. terraereginae AY294453
AY294451 USA Price và CS. 2004
Apus apus JQ353938 Đức Mol và CS, 2012
Amazilia tzacatl U89180 USA Mol và CS, 2000
e) Phân tích di truyền quần thể lồi Aerodramus fuciphagus
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen Cytb mtDNA của chim yến cho tổ trắng ăn được thu tại 155 Thống Nhất và Đảo Hòn Mun (Nha Trang), Trảng Bom-Đồng Nai từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2012 bao gồm 65 trình tự trong đó có 20 trình tự Cytb mtDNA của A. fuciphagus từ nghiên cứu hiện tại và 45 trình tự Cytb mtDNA của Aerodramus từ Genbank. Trình tự của 2 lồi chim yến
Apus apus (JQ353928) và Amazilia tzacatl (U89180) từ Genbank được sử dụng làm
nhóm ngoại trong phân tích mối quan hệ lồi bằng cây tiến hóa.
Phân tích mối quan hệ lồi bằng cây tiến hóa và đa dạng di truyền chim yến được tiến hành dựa trên 3 thuật toán maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và Neighbor-Joining (NJ). Khi tiến hành xây dựng cây phát sinh lồi trong quần thể ở Nha Trang–Khánh Hịa, chúng tôi sử dụng phần mềm Mega phiên bản 5.0 [40] với cả 3 thuật toán MP, ML và NJ. Tuy nhiên khi tiến hành phân tích cây phát sinh loài của loài chim yến từ Việt Nam với các lồi khác trên thế giới, chúng tơi tiến hành phương pháp MP và NJ trên phần mềm Mega phiên bản 5.0 [40] và phương pháp ML bằng phần mềm PAUP 4.0 [73] và MyBayes 3.1.2 [33].
Đối với thuật toán MP, 1000 độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng. Tuy nhiên, đối với thuật tốn ML, độ lặp lại là 100 vì thời gian chạy thuật toán này khá lâu. Trước khi tiến hành thuật tốn ML các mơ hình tiến hóa được kiểm tra bằng phần mềm Modeltest 3.7 [61]. Các thơng số của q trình phân tích các trình tự và mơ hình tiến hóa (best-fit-model) của phân tích di truyền quần thể A. fuciphagus được
lựa chọn bởi phần mềm Modeltest 3.7, sử dụng tính năng Akaike Information Criterion được trình bày ở bảng 2.4
Giá trị boostrap (BT) được tính tốn để xác định tính chính xác của thuật tốn MP với độ lặp lại 100. Do sự hạn hẹp về thời gian và số lượng trình tự quá lớn, phương pháp successive approximation approach được áp dụng đối với thuật tốn ML [72], xác định cây tiến hóa dựa trên mơ hình tiến hóa, so sánh kết quả thu được với phương pháp phân tích MP. Cây đa dạng lồi được biểu hiện và hiệu chỉnh bằng phần mềm TreeView 1.6.6 [57].
Các trình tự được dóng hàng bằng cách sử dụng phần mềm Mega phiên bản 5.0 [40]. Phần mềm DnaSP phiên bản 4.0 được sử dụng để xác định các haplotype [66] và ước tính đa dạng di truyền trong quần thể haplotype (h) và sự đa dạng nucleotide (π) [52].
Bảng 2.4: Các thơng số của q trình phân tích các trình tự và mơ hình tiến hóa
(best-fit-model) giữa chim yến Việt Nam với chim yến của thế giới
Thông số Dữ liệu gen Cytb mtDNA
Tổng số trình tự 66
Tổng số nucleotide dóng hàng 214 Vị trí khơng đổi (Constant sites) 149 Vị trí khơng mang thơng tin
(Parsimony uninformative) 40 Vị trí mang thơng tin
(Parsimony informative ) 25
Mơ hình tiến hóa (Best-fit-model) TrN+I Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide
equilibrium) Frequency µ (A, C, G, T)
fA(0.3080), fC(0.4077), fG(0.0808), fT(0,2035)
Chƣơng III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG SINH HỌC CỦA CHIM YẾN 3.1.1 Đặc trƣng sinh học chim yến đảo 3.1.1 Đặc trƣng sinh học chim yến đảo
Hình thái: có kích thước nhỏ, cánh dài trung bình 11,5-12,2cm, nặng 12,09- 14,28 gram (bảng P.1) ; lưng màu nâu đen, cánh, đầu đen đậm, hơng màu nâu xám; giị khơng có lơng hoặc rất ít lơng nhỏ; làm tổ hồn tồn bằng nước bọt.
Sống làm tổ tại các hang động ven biển: A1, A2, A6 và phân bố tập trung chủ yếu ở khu vực đảo Hịn Mun, tỉnh Khánh Hịa.
Tập tính sống: cả con đực và cái cùng nhau làm tổ, cùng ấp và nuôi chim con. Chim yến sinh sống khá ổn định, bay đi, bay về đúng hang, đúng tổ theo những hướng khá ổn định… Mục đích chim yến hàng làm tổ là để đẻ trứng, ấp và nuôi con chứ không phải làm tổ để ở. Do vậy, chúng không di cư vào mùa đơng.
3.1.2 Đặc trƣng sinh học chim yến nhà
Hình thái: là lồi có kích thước nhỏ (nhỏ hơn chim yến sống ở đảo), chiều dài cánh trung bình 11-12cm, trọng lượng trung bình 12-13 gram (bảng P.1). Có lơng màu xám đen và ánh xanh ở đuôi.
Nhịp sinh sản phụ thuộc vào phương pháp thu hoạch tổ. Nếu mỗi lần sau khi