Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
1.2.1 Lông chim
Bộ lông vũ của chim rất nhẹ, bền, có lực đàn hồi lớn, được sinh ra từ biểu bì. Cấu tạo một lơng bao điển hình gồm có hai phần: phần to rỗng là gốc cắm vào da khơng có phiến lơng và phần đặc, thn nhỏ là thân lơng có hai phiến lơng ngồi và trong. Gốc lơng có hai lỗ nhỏ là lỗ lơng trên và lỗ lơng dưới. Bên trong gốc lơng có một sợi hình chng màu trắng là bấc lơng. Đó là di tích mạch máu ni lơng khi lơng đang phát triển. Hai bên thân lơng có các sợi lơng mảnh xếp sít vào nhau thành hai phiến lơng, phân thành các lơng thứ cấp. Các lơng thứ cấp móc vào nhau thành tấm vững chắc (Hình1.9) [7].
Hình 1.9: Cấu tạo lông chim (theo Raven) (www.thuviensinhhoc.com)
1. Gốc lông; 2. Thân lông; 3. Sợi lông; 4. Lông tơ
Yếu tố cấu trúc chính của lơng là keratin. Xét theo chiều dài, lông là một cấu trúc bị keratin hóa từ gốc dần lên ngọn. Càng đi xa khỏi gốc thì mức độ keratin hóa càng mạnh, các tế bào mất dần DNA của mình và trở thành một chuỗi protein ở phần ngọn. Phần gốc lơng cịn chứa nhiều tế bào sống [7].
Việc sử dụng bộ lông trong tách chiết DNA đã đơn giản hóa việc lấy mẫu DNA bộ gen gia cầm, đặc biệt là khi tách chiết từ máu gặp khó khăn về kích thước và tuổi của chim [51].
1.2.2 Hệ gen ty thể (Mitochondrial DNA-mtDNA)
1.2.2.1 Cấu trúc DNA ty thể
Hệ gen ty thể là phân tử DNA trần, kép, mạch vòng nhỏ (15-20kb) gồm hai chuỗi: chuỗi nặng (H strand) giàu guanine và chuỗi nhẹ (L strand) giàu cytosine. Khác với DNA nhân, mtDNA không liên kết với protein histon, điều này làm cho mtDNA tương tự với DNA của vi khuẩn.
Hệ gen ty thể chim mang những đặc trưng của hệ gen ty thể động vật có xương sống và có độ tương đồng rất cao khi so sánh với mtDNA của lưỡng cư và động vật có vú, tức là cũng gồm hai vùng là vùng mã hóa và vùng điều khiển (D- loop). Vùng khơng mã hóa chiếm 7% mtDNA, chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng (OH) và các promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (PH và PL), khoảng 90% phần DNA khơng mã hóa của ty thể nằm trong vùng này.
Vùng mã hóa chứa 37 gen và khơng có khoảng trống giữa các gen, mã hóa cho 13 polypeptide, 2rRNA và 22 tRNA. Trong đó, chuỗi nặng chứa 12 trong 13 gen mã hóa polypeptide (trừ một tiểu phần ND6 của phức hệ I là được phiên mã tờ chuỗi nhẹ), 14 trong 22 gen tRNA và cả hai gen rRNA (12S và 16S). 13 chuỗi polypeptide được mã hóa bởi DNA ty thể là thành phần của phức hệ hô hấp của ty thể, trong đó có 7 tiểu phần (ND1, 2, 3, 4L, 4, 5, 6) trong số 46 chuỗi polypeptide của phức hệ I (NADH dehydrogenase), 1 tiểu phần (cytochrome b-Cytb) trong số 11 chuỗi polypeptide của phức hệ III ( Phức hệ bc1), 3 tiểu phần (cytochrome oxydase- CO I, II, III) trong số 13 polypeptide của phức hệ IV (cytochrome c oxidase) và 2 tiểu phần (ATPase 6 và 8) trong số 16 polypeptide của phức hệ V (ATP synthase)
[22]. Còn tấc cả các protein khác của ty thể bao gồm cả 4 tiểu đơn vị của phức hệ II (succinate dehydrogenase), tiểu đơn vị DNA polymerase γ của ty thể, các thành phần của RNA polymerase của ty thể, yếu tố phiên mã của ty thể (mtTFA), các protein ribosome của ty thể, các yếu tố kéo dài chuỗi và các enzyme trao đổi chất của ty thể đều được mã hóa bởi DNA nhân [71].
Bộ gen ty thể của các lồi chim và động vật có vú được mơ tả bởi Desjardins và Morais (1990), Mindell và CS (1998). Bộ gen của ty thể được bố trí rất hiệu quả, nó thiếu các intron, có các đoạn đệm giữa các gen nơi chứa khung đọc đôi khi gối
lên nhau. Gen tRNA được xác định bởi 1 mã kí tự amino acid. Bên ngồi vịng trịn đại diện cho chuỗi nặng (H) và bên trong vòng tròn là chuỗi nhẹ (L). Phân cực của phiên mã và chuỗi sao chép được hiển thị với các đầu mũi tên. Khi khơng có đầu mũi tên được đánh dấu gen được phiên mã từ chuỗi nặng (H) với phân cực theo chiều kim đồng hồ. Các vùng được sử dụng trong nghiên cứu được đánh dấu bằng màu xám đen tối (hình 1.10) [14], [48]
Hình 1.10: Hệ gen ty thể của các lồi chim (a, b) và động vật có vú và
Mặc dù nhiều tính năng đều giống nhau trong tấc cả các mtDNA động vật có xương sống, bộ gen gia cầm có một số khác biệt đáng chú ý:
- Đầu tiên, trình tự gen gia cầm là mới lạ so với hệ gen ty thể của động vật có vú và động vật lưỡng cư (hình 1.9). Theo chiều 5’-3’ của chuỗi nhẹ từ gen ND5 (nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 5) đến vùng D- loop là các gen Cytb, tRNAThr, tRNAPro, ND6 và tRNAGlu [16], [17], [64], trong khi ở các động vật khác, gen Cytb lại nằm gần hơn với vùng điều khiển. Sắp xếp này có thể đã phát sinh do nhân bản thông qua sự trượt sao chép kế tiếp bởi ít nhất hai sự kiện xóa độc lập [64].
- Thứ hai, một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữa hai gen tRNACys và tRNAAsn đều có ở tấc cả động vật có xương sống đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gia cầm khơng có đặc điểm này [16], [17].
- Thứ ba, gen COI (cytochrome oxydase I) có mã khởi đầu là GTG thay vì ATG và có bằng chứng cho thấy tỷ lệ thấp của thymine tại các vị trí im lặng trong khu vực mã hóa [65].
Chức năng di truyền của ty thể có hai chức năng chủ yếu : (1) mã hóa nhiều thành phần của ty thể: hai loại rRNA, tất cả các tRNA trong ty thể và nhiều loại protein có trong thành phần của màng bên trong ty thể; (2) mã hóa cho một số protein tham gia chuỗi truyền điện tử.
1.2.2.2 Đặc điểm hệ gen ty thể (mtDNA)
- Tốc độ đột biến lớn gấp 5-10 lần so với hệ gen nhân [10]. - Số lượng bản sao lớn [37], [53], [67].
- Đơn bội, hầu như khơng có sự tái tổ hợp [28], [53], [70].
- Di truyền theo dịng mẹ ở phần lớn các lồi [12], [28], [37], [53].
Phân tử DNA ty thể có tốc độ đột biến nhanh hơn 5-10 lần so với các gen nhân do cơ chế sửa chữa tái bản DNA khơng hiệu quả do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các lồi mà cịn cả trong một lồi. Bên cạnh đó, các biến dị này khơng giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế
bào khác nhau. Do đó, dựa vào tốc độ thay đổi nucleotide có thể xác định thời gian tiến hóa, xác lập đồng hồ phân tử. DNA ty thể có đặc điểm đơn bội, khơng tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa là mỗi phân tử cũng như tồn bộ DNA ty thể thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dịng mẹ. Thêm vào đó DNA ty thể tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào. Các đặc điểm trên cùng với việc DNA ty thể bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng [34], nên sử dụng DNA ty thể như là một cơng cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong lồi và giữa các lồi có nhiều thuận lợi [24], [50], [56].
Đáng chú ý là trật tự sắp xếp của các gen trong phân tử DNA dạng vịng có thể khơng giống nhau giữa các lồi, điều này được thể hiện rõ khi so sánh trình tự bộ gen ty thể các taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các đặc điểm về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng được sử dụng như một dấu hiệu phân loại đối với các taxon bậc cao [48].
1.2.2.3 Cytochrome b
Cytochrome b là một trong những cytochrome tham gia vào quá trình vận chuyển electron trong chuỗi hô hấp của ty thể. Cytochrome b chứa 8 xoắn màng kết nối bởi vùng intramembrane hoặc extramembrane (hình 1.11) [20]. Cytochrome b chỉ được mã hóa bởi DNA ty thể.
Hình 1.11: Cấu trúc của protein cytochrome b [20]
Cytochrome b là gen được sử dụng rộng rãi nhất trong việc phát sinh lồi vì nhiều lí do. Mặc dù nó phát triển chậm trong điều kiện thay thế không đồng nghĩa,
tốc độ tiến hóa ở các vị trí im lặng tương đối cao [35]. Việc sử dụng rộng rãi cytochrome b đã làm cho nó như một thước đo chung mang ý nghĩa rằng có thể dễ dàng so sánh các nghiên cứu. Cytochrome b được cho là biến đủ cho câu hỏi cấp độ quẩn thể và bảo tồn đủ để làm rõ mối quan hệ phát sinh loài sâu hơn. Tuy nhiên, gen cytochrome b đang được ràng buộc với khả năng tiến hóa vì một số vùng của gen được bảo tồn nhiều hơn các gen khác do hạn chế chức năng [47]. Hầu hết các vị trí thay đổi được nằm trong các vùng mã hóa cho các khu vực xuyên màng hoặc kết thúc bằng amino-carboxy-terminal [36].
Cho đến nay, cytochrome b đã có được các nguồn phổ biến nhất của dữ liệu trình tự trong các nghiên cứu gia cầm. Mặc dù sử dụng cytochrome b có một số khó khăn, Moore và DeFilipps lập luận rằng dù sao đi nữa cũng là sự lựa chọn tốt nhất để giải quyết tương đối cho lịch sử tiến hóa gần đây [49]. Xu hướng của các lồi chim có tỷ lệ sai khác di truyền thấp ở phân loài bậc cao so với các loại động vật có xương sống khác làm cho cytochrome b như là chỉ thị marker tốt nhất. Helm- Bychowski và Cracraft đã cung cấp ví dụ tốt về sự sai khác di truyền thấp trong một nghiên cứu phát sinh loài chim bộ Sẻ [29].
Sự sai khác di truyền gen cytochrome b cho rằng một số phân loài cần được nâng lên đến loài trong Tanager [27], và trong phân loại học của chim yến (Apodidae) dựa trên sự hiện diện hay vắng mặt của khả năng định vị bằng tiếng vang (echolocating) [41]. Các chuỗi cytochrome b được sử dụng thành công để xác định các nhóm phân loại ngay cả ở phân lồi, ví dụ như trong chim Uria (Uria
aalge) [23].