Kí hiệu: 1, 2, 3: mẫu DNA chim yến tách chiết từ lông; 4, 5, 6, 7: mẫu DNA tách chiết từ mô cơ; MK: thang marker.
Các mẫu 1 đến 4 không xuất hiện các băng là do nồng độ DNA tổng số tách chiết từ lơng q ít hoặc khơng có. Đối với những mẫu này cần thử nghiệm khuếch đại gen trực tiếp mà không qua bước kiểm tra nồng độ DNA tổng số.
Chính vì vậy mà khi khuếch đại gen Cytb mtDNA bằng kĩ thuật PCR đối với mẫu lơng thì lượng DNA mẫu đưa vào là 10µl nhiều hơn so với lượng DNA mẫu mơ cơ là 1µl.
3.2.2 Xây dựng chƣơng trình PCR khuếch đại trình tự gen Cytb DNA ty thể
3.2.2.1 Thiết kế mồi và kiểm tra đặc tính của mồi trên lý thuyết
Cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 được thiết kế để khuếch đại đoạn trình tự có kích thước 500bp và cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2 khuếch đại đoạn trình tự có kích thước 700bp [16], [48].
Các đặc tính của mồi bao gồm: kích thước, nhiệt độ biến tính, tỷ lệ GC, cấu trúc cặp tóc… được kiểm tra bằng phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer 3.0 (http://www.idtdna.com) (bảng 3.2)
Bảng 3.1: Các đặc tính của mồi
Tên mồi Độ dài
Nhiệt độ biến tính (Tm, oC) Thành phần GC (%) Seldf- dimer G (Kcal/mol) Hetero- dimer G (Kcal/mol) Cytb FW1 20 53,5 50 -3,17 Cytb RV1 18 53,6 50 -4,16 -6,14 Cytb RV2 21 53,1 33,3 -8,31 -5,24
Từ kết quả trên, chúng tơi nhận thấy rằng:
Về kích thước: cặp mồi có chiều dài đạt yêu cầu (18-25bp) cho phép khả năng nhân bản tốt nhất.
Về nhiệt độ biến tính: sự chênh lệch nhiệt độ biến tính giữa mồi xi và mồi ngược khơng lớn, dao động trong khả năng cho phép, đảm bảo cho khả năng bắt cặp tốt nhất của chúng trong cùng điều kiện nhiệt độ.
Về thành phần GC: do đoạn gen khảo sát nằm trong vùng có % GC không cao, nên tỷ lệ GC của mỗi cặp mồi cũng khơng cao. Theo Desjardins và Morais thì trình tự Cytb RV2 cho kết quả phân tích mồi không tốt nên chúng tôi đã thiết kế mồi Cytb RV1 (mồi Cytb RV1 có %GC nằm trong khoảng tỷ lệ tốt nhất cho sự khuếch đại của mồi 40-60%) [16], [48]). Tuy nhiên theo thực nghiệm, mặc dùng % GC không cao nhưng Cytb RV2 vẫn khuếch đại sản phẩm tốt
Kết quả kiểm tra sự tạo thành cấu trúc thứ cấp của các mồi cho thấy:
Các mồi đều có sự tạo thành cấu trúc cặp tóc (hairpin) và cấu trúc tự mồi (self-dimer). Tuy nhiên, các cấu trúc này đều có năng lượng tự do lớn hơn -9 kcal/mole (thường thì các cấu trúc thứ cấp có lớn hơn -9kcal/mol sẽ không gây ảnh hưởng đến hoạt động của mồi) (Hình 3.2).