Hình 3 .4 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi
Hình 3.5 Kết quả khảo sát nồng độ DNA từ mẫu lông chim
a) cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1; MK: thang DNA 1000bp. b) cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2; MK: thang DNA 3000bp
Trong đó: mẫu 1 đến 6 tương ứng với các nồng độ DNA 4 µl, 6 µl, 8 µl, 10 µl, 12 µl, 14 µl
Từ hình 3.5 cho thấy các mẫu 1 khơng cho băng vì nồng độ DNA quá thấp không đủ thực hiện phản ứng PCR. Các mẫu còn lại đều xuất hiện băng ở mức độ đậm nhạt khác nhau, trong đó mẫu 4 ở nồng độ DNA tổng số là 10µl cho băng đậm rõ nét nhất. Do đó, tại nồng độ DNA tổng số tách chiết từ lơng chim 10µl là nồng độ tối ưu cho cả 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2.
3.2.3 Giải trình tự DNA chim yến
Sản phẩm PCR của đoạn gen Cytb DNA ty thể tiếp tục được tinh sạch bằng bộ kit của hãng Promega phục vụ cho việc giải trình tự trực tiếp. Dữ liệu giải mã DNA được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng. Kết quả, chúng tơi đã giải trình tự DNA của 20 mẫu chim yến A. fuciphagus.
Sử dụng các trình tự này chúng tôi đã xây dựng được cây đa dạng loài A. fuciphagus ở các vùng địa lý tại Khánh Hịa dựa trên trình tự gen Cytb mtDNA.
3.2.4 Đa dạng di truyền A. fuciphagus
3.2.4.1 Đa dạng haplotype
Sau khi so sánh, dóng hàng, phân tích trình tự Cytb mtDNA 514bp của 11 cá thể chim yến A. fuciphagus ở đảo A2-Hòn Mun-Khánh Hịa (được kí hiệu là: Y1- NT-A2, Y3-NT-A2, Y8-NT-A2, Y9-NT-A2, Y11-NT-A2, Y14-NT-A2, Y15-NT- A2, Y16-NT-A2, Y17-NT-A2, Y18-NT-A2, Y21-NT-A2), thu được: tổng số haplotype (k) = 2 với đa dạng haplotype là h = 0,167 ± 0,134, đa dạng nucleotide = 0,00270 và số lượng vị trí đa hình (polymorphic sites) là s = 9, số đột biến Eta = 9, sự khác biệt trình tự là 1,5%.
Phân tích trình tự Cytb mtDNA 514bp của 8 cá thể chim yến A. fuciphagus ở 155-Thống Nhất-Nha Trang (kí hiệu là: Y2-NT-155TN, Y4-NT-155TN, Y5-NT- 155TN, Y6-NT-155TN, Y7-NT-155TN, Y10-NT-155TN, Y12-NT-155TN, Y13- NT-155TN), thu được: tổng số haplotype (k) = 3 với đa dạng haplotype là h = 0,464±0,200, đa dạng nucleotide = 0,0009 và số lượng vị trí đa hình (polymorphic sites) là s = 2, số đột biến Eta = 2, sự khác biệt trình tự là 0,5%.
Phân tích trình tự Cytb mtDNA 514bp của 19 cá thể A. fuciphagus cả Khánh Hòa (11 cá thể ở A2-Hòn Mun và 8 cá thể ở 155-Thống Nhất), thu được: tổng số haplotype (k) = 4 với đa dạng haplotype là h = 0,591±0,088, đa dạng nucleotide = 0,00131 và số lượng vị trí đa hình (polymorphic sites) là s = 3, số đột biến Eta = 3, sự khác biệt trình tự là 0,725%.
Phân tích trình tự Cytb mtDNA 514bp của 29 cá thể A. fuciphagus ở Việt
Nam (19 cá thể ở Khánh Hòa, 1 cá thể ở Trảng Bom-Đồng Nai và 9 lấy từ Genbank), thu được: tổng số haplotype (k) = 3 với đa dạng haplotype là h = 0,135±0,085 đa dạng nucleotide = 0,00225 ± 0,00156 và số lượng vị trí đa hình (polymorphic sites) là s = 6, số đột biến Eta = 6, sự khác biệt trình tự là 0,478%
Tuy nhiên, sau khi so sánh và dóng hàng thì trình tự Cytb mtDNA của 65 cá thể Aerodramus spp. (20 cá thể từ nghiên cứu hiện tại và 45 lấy từ Genbank) chỉ cịn 214bp được sử dụng cho phân tích haplotype, thu được: tổng số haplotype (k) = 19 với đa dạng haplotype là h = 0,743±0,043, đa dạng nucleotide = 0,0307±0,0063 và số lượng vị trí đa hình (polyphormic sites) là s = 66, số đột biến Eta = 86, sự khác biệt trình tự là 6,4817%.
Các giá trị phân tích Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus spp. được biểu hiện ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Các giá trị phân tích Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus spp
Vùng thu mẫu N s
Đa dạng di truyền
k Eta H
155-Thống Nhất-Nha
Trang 8 2 3 2 0,464±0,200 0,0009
Đảo A2-Hòn Mun-
Nha Trang 11 9 2 9 0,167±0,134 0,00270 155-Thống Nhất và
Đảo A2-Hòn Mun 19 3 4 3 0,591±0,088 0,00131 Việt Nam (Đặng và
CS, 2011) 9 2 2 2 0,222±0,0276 0,0021 Nghiên cứu hiện tại và
Việt Nam 29 6 3 6 0,135±0,085 0,00225 Thái Lan 10 1 2 1 0,2±0,02376 0,00094 Malaysia và Sumatra 10 9 6 9 0,844±0,103 0,01006 Thế giới 65 66 19 86 0,743±0,043 0,0307
3.2.4.2 Đa dạng di truyền
Quần thể A. fuciphagus tại 2 vùng địa lý ở Khánh Hòa cho thấy đa dạng di
truyền ở mức độ trung bình (4 haplotype/19 cá thể) với sự khác biệt trình tự trung bình là 0,725%. Trong đó 2 haplotype/11 cá thể tại đảo A2 Hịn Mun, sự khác biệt trình tự là 0,2÷2,6% (có những cặp cá thể cho giá trị tương đồng rất cao như: Y3- Y8_A2; Y8-Y9_A2; Y18-Y14_A2, những cá thể khác lại cho sự khác biệt trình tự lên đến 10,1±12,7%); 3 haplotype/8 cá thể tại 155-Thống Nhất trình tự khác biệt khá cao 2.2÷66,8%, nhưng giữa Y4-155TN và Y12-155TN có sự tương đồng khá cao và sự khác biệt trình tự là thấp nhất trong quần thể yến nhà 0,6%. Sự khác biệt trình tự của chim yến A. fuciphagus tại Khánh Hòa được thể hiện chi tiết ở bảng
3.3, bảng 3.4, bảng 3.5
Sự khác biệt trình tự của quần thể A. fuciphagus tại Thái Lan là khoảng 0,2% Sự khác biệt trình tự của quần thể A. fuciphagus tại Malaysia và Sumatra là
khoảng 2,13%
Bảng 3.3: Giá trị tương đồng (%) của các haplotype trình tự Cytb mtDNA
của chim yến A. fuciphagus thu tại Khánh Hòa, Việt Nam
Bảng 3.4: Giá trị tương đồng và giá trị khác biệt (%) của các haplotype trình tự
Cytb mtDNA của A. fuciphagus thu tại đảo A2-Hòn Mun-Nha Trang
Bảng 3.5: Giá trị tương đồng và giá trị khác biệt (%) của các haplotype trình tự
3.2.5 Đa dạng di truyền quần thể chim yến A. fuciphagus
Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự gen Cytb mtDNA của 22 cá thể của
A. fuciphagus (20 cá thể từ nghiên cứu hiện tại gồm 19 cá thể yến đảo và yến nhà ở
Khánh Hòa; 1 cá thể ở Đồng Nai và 2 cá thể từ nhóm ngoại trên Genbank) dựa trên 3 phương pháp MP, ML, NJ cho kết quả tương tự về cây đa dạng di truyền lồi chim yến A. fuciphagus (Hình 3.7). Giá trị bootstrap (BT) và giá trị tin cậy (PP) của thuật toán MP, ML và NJ được biểu hiện trên các nhánh.
Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài yến ở Việt Nam với các loài trên thế giới, chúng tơi đã phân tích sử dụng trình tự Cytb mtDNA của 19 haplotype của loài chim yến Aerodramus spp. (từ nghiên cứu hiện tại và từ Genbank). Loài Apus apus và Amazilia tzacatl được sử dụng làm nhóm ngoại. Khi so sánh và dóng hàng các trình tự gen này, chỉ có 214 bp được sử dụng cho phân tích di truyền. Trong đó 149 nucleotide khơng đổi (characters are constant); 40 nucleotide không mang thông tin (veriable characters are parsimony uninformative) và 25 nucleotide có mang thơng tin (parsimony informative). Mơ hình tối ưu là TrN+I với tần số các base nitơ là A= 0,3080; C= 0,4077; G= 0,0808; T= 0,2035 (Bảng 2.4)
Hình 3.6: Cây đa dạng loài dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến
Aerodramus fuciphagus xây dựng theo phương pháp maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và Neighbor Joining (NJ).
Kết quả được trình bày ở Hình 3.8 với cây đa dạng di truyền thu được từ phân tích MP, ML giá trị bootstrap (BT) và giá trị tin cậy (PP) của thuật toán MP, ML được biểu hiện trên các nhánh. Đối với thuật tốn MP, cây đa dạng lồi với 101 bước (Consistency index (CI) = 0,8416; Homoplasy index (HI) =0,1584; chỉ số thay đổi tỷ lệ nhất quán (Rescalted consistency index_RC) = 0,7707; chỉ số duy trì (Retention index_RI)= 0,9158).
Phương pháp ML cho kết quả cây phân loài khá rõ ràng, yến đảo và yến nhà ở Khánh Hòa phân thành 2 nhóm riêng biệt, kiểm tra các trình tự tương đồng của 2 nhóm này trên BLAST chúng tơi tạm gọi nhóm yến đảo và yến nhà là loài A. fuciphagus nhưng chúng cùng nằm trong nhóm yến của Việt Nam đã được Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Hà Nội định danh đến phân loài A. f. germane.
Nhóm A. fuciphagus tại Việt Nam lại có mối quan hệ gần gũi với các loài A. salangana, A. francicus, A. elaphrus ở USA (giá trị bootstrap 56/100). Các nhóm
yến A. fuciphagus lấy từ Thái Lan, Malaysia và Sumatra, Hồng Kông, Hà Lan tách hẳn ra một nhánh riêng, là nhánh có quan hệ gần gũi với các lồi ở Việt Nam (giá trị bootstrap 46/100). Cá thể yến thu ở Trảng Bom-Đồng Nai xếp chung với các loài A.
fuciphagus ở Thái Lan, Malaysia_Sumatra và Hồng Kông. Mặc khác, khi tìm kiếm
các trình tự tương đồng trên BLAST của trình tự yến ở Trảng Bom- Đồng Nai cho kết quả đến phân loài là A. f. vestitus. Chi Hydrochous gigas là trung gian giữa A. fuciphagus (bộ lơng nhẵn bóng, có định vị bằng tiếng vang) với lồi A. maximus (bộ
lơng khơ khốc, khơng định vị bằng tiếng vang) được thể hiện rõ trên cây phân loài, điều này giống với kết quả nghiên cứu của Brooke [11].
Hình 3.7: Cây đa dạng lồi dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến A. fuciphagus
thu tại Khánh Hòa, Việt Nam và một số khu vực khác trên thế giới; Apus apus và Amazilia tzacatl là nhóm ngoại (outgroup). Các giá trị bootstrap (phân tích ML)
3. 3 THẢO LUẬN
3.3.1 Phân loại chim yến (Aerodramus spp.) dựa vào đặc điểm hình thái
Phương pháp hình thái học được xem là phương pháp truyền thống trong việc phân loại các lồi chim yến. Sự ít ỏi của các đặc điểm phân biệt hình thái giữa các lồi chim yến đã dẫn đến sự tin cậy vào các đặc điểm tập tính: định vị bằng tiếng vang, cấu trúc tổ, để sắp xếp các đơn vị phân loại. Brooke và CS (1972) xếp loài định vị bằng tiếng vang trong chi Aerodramus, tách biệt các lồi khơng định vị bằng tiếng vang [10]. Nhóm nghiên cứu cho rằng những đặc điểm này khơng có mối liên hệ với phát sinh lồi của chim yến. Tính nhất qn giữa hành vi xây dựng tổ và phát sinh lồi là khơng rõ ràng. Các đặc điểm duy nhất hiển thị sự phù hợp với phát sinh lồi là việc sử dụng lơng trong cách xây tổ, nhưng sự phù hợp này phụ thuộc vào vị trí của Hydrochous gigas, là khơng chắc chắn.
3.3.2 Hiệu quả phƣơng pháp PCR
Phillip và CS (1994), đã tách chiết thành công DNA từ gốc lông chim đã được lưu trữ trong vịng 1÷3 năm theo 2 phương pháp khác nhau là: phương pháp sử dụng proteinase K, ủ ở 56oC trong 4-12 giờ và phương pháp dùng Chelex 5%. Sau đó khuếch đại DNA tách chiết từ lơng này bằng gen Cytb mtDNA (340bp) với cặp mồi L14841/H15149. Nhóm nghiên cứu đã thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích là 25µl, trong đó: dùng 1µl DNA khn đối với phương pháp thứ nhất hoặc 10µl DNA khn đối với tách chiết bằng Chelex 5%, 10mM Tris (pH=8,3), 50mM KCl, 0,01% gelatin, 1,5mM MgCl2, 0,1µg/µl BSA, 0,2mM mỗi dNTP, 0,4µM mỗi mồi và 1 đơn vị Taq polymerase. Phản ứng trên được chạy theo chu trình nhiệt: 40 chu kỳ của 92oC trong 1 phút, 55oC trong 1 phút và 74oC trong 30 giây. Kết quả nghiên cứu cho thấy DNA tách chiết theo phương pháp Chelex 5% cho chất lượng kém hơn phương pháp thứ nhất và sản phẩm khuếch đại PCR được đưa đi gải trình tự tạo cây phát sinh loài tốt [60].
Đối chiếu với nghiên cứu của chúng tôi, mặc dù sử dụng bộ kit MagaZorb DNA Mini-Prep Kit của Promega tách chiết DNA từ lông hiện đại hơn, thời gian ủ
proteinase K ở 56oC trong 16÷24 giờ lâu hơn nhưng DNA tách chiết tổng số rất thấp hoặc khơng có. Mặc khác, khi thực hiện phản ứng PCR, nồng độ DNA khuôn đối với mẫu lông đưa vào gấp 10 lần so với nghiên cứu của Phillip và CS (1994) và nhiệt độ lai ứng với cả 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2 là 54oC không khác biệt lắm so với nghiên cứu của Phillip và CS (1994). Sản phẩm PCR tách chiết từ mẫu lông (mẫu Y27-Trảng Bom, Đồng Nai) vẫn cho trình tự DNA tốt. Kết quả này có thể là do mẫu lơng của chúng tơi thu được là lơng bụng nhỏ, phần gốc lơng ít hoặc khơng có.
3.3.3 Đa dạng di truyền quần thể chim yến A. fuciphagus
So sánh sự khác biệt trình tự giữa chim yến tại một số khu vực trên thế giới thì thấy trình tự khác biệt của cá thể có nguồn gốc từ Việt Nam (0,478%) cao hơn quần thể ở Thái Lan (0,2%) và thấp hơn nhiều so với quần thể ở Malaysia và Sumatra (2,13%).
Trong nghiên cứu này chúng tôi tạm gọi các cá thể yến ở Nha Trang-Khánh Hòa là A. fuciphagus. Mặc khác, dựa trên cây phát sinh lồi (hình 3.10) ta thấy
nhóm yến Việt Nam bao gồm cả các haplotype của các cá thể yến đảo và yến nhà thu tại Nha Trang- Khánh Hòa. Điều này cho thấy quan hệ gần gũi của các haplotype này với nhóm yến được nghiên cứu bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Hà Nội-Việt Nam hay đó là sự gần gũi di truyền giữa cá thể yến Nha Trang-Khánh Hòa với nhóm yến A. f. germani. Mặc khác, theo Nguyễn Quang
Phách và cs thì nhóm yến cho tổ trắng ăn được (A. fuciphagus) chỉ phân bố ở khu vực miền Trung-Tây Nguyên Việt Nam [3], [4], [59] và các cá thể yến được nghiên cứu bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Hà Nội chưa xác định rõ là thu mẫu ở nơi nào trên Việt Nam, do đó sự gần gũi di truyền này là khá cao và có thể là cùng phân loài A. f. germane.
Cá thể yến ở Trảng Bom - Đồng Nai tách hẳn ra một nhóm với các cá thể yến ở Nha Trang-Khánh Hịa và thuộc nhóm yến ở Thái Lan, Malaysia_ Sumatra, Hồng Kơng và Hà Lan. Khi tìm kiếm các trình tự tương đồng trên Blast thì cá thể yến ở Trảng Bom- Đồng Nai tương đồng với trình tự A. f. vestitus dựa trên phân tích
trình tự Cytb ở Malaysia nhất, % tương đồng cao đến 99%, giá trị E-value = 0. Do đó sự tương đồng giữa 2 trình tự này rất có ý nghĩa. Đối với các lồi khác % bắt cặp khơng cao, đồng thời giá trị E-value cũng khá lớn thể hiện mức tin cậy thấp. Vì vậy, chúng tơi tạm gọi cá thể yến ở Trảng Bom-Đồng Nai là A. f. vestitus.
Price và CS (2005) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài trên 62 cá thể chim yến sử dụng các trình tự Cyt-b (1058bp) phân tích dựa trên cây maximum likelihood (ML) đặt A. brevirostris là nhóm gần gũi với A. maximus và A. fuciphagus là nhóm gần gũi với A. salangana. Mặc khác, A. fuciphagus tách hẳn ra
nhánh đơn ngành khác biệt với A. maximus và H. gigas là nhóm trung gian giữa A.
maximus và A. fuciphagus. Mặc khác A. terraereginae là một nhóm gần gũi với A. fuciphagus, H. gigas và A. maximus [36]. Kết quả này khá tương đồng so với
nghiên cứu của chúng tôi
Kevin và CS (1999) nghiên cứu trên 18 cá thể chim yến sử dụng trình tự Cytb mtDNA (1037 cặp base), cho thấy A. elaphrus và A. francicus sự khác biệt
trình tự là 1,0%. Hai loài này là một nhánh đơn ngành của yến nhỏ có âm dội. A. elaphrus và A. francicus có quan hệ họ hàng rất gần nhau và là nhánh chị em với
loài A. salangana [39]. Kết quả này cũng được thể hiện rõ trên cây phát sinh loài
của chúng tơi, ngồi ra trên cây phát sinh lồi cịn thể hiện quần thể yến Việt Nam (A. fuciphagus) là nhóm gần gũi với lồi A. salangana và có định vị bằng tiếng
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN KẾT LUẬN
1. Tách chiết được DNA tổng số của chim yến A. fuciphagus từ 2 mẫu lông và mô cơ thu tại Nha Trang- Khánh Hịa.
2. Tối ưu hóa phản ứng khuếch đại gen Cytb mtDNA của chim yến nói trên. Nồng độ DNA dùng cho phản ứng PCR, đối với mẫu mơ cơ là 1µl, mẫu lơng chim là 10µl. Nồng độ mồi dùng trong phản ứng PCR: Cytb FW1/Cytb RV1 (10µM/l) là 1µl, Cytb FW1/Cytb RV2 (10µM/l) là 0,75µl. Chương trình nhiệt phản ứng khuếch đại gen Cytb mtDNA (sử dụng được cho cả 2 cặp mồi: mồi xuôi FW1- mồi ngược RV1 và mồi xuôi FW1- mồi ngược RV2) như sau: biến tính ban đầu tại 95oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 95oC trong 30 giây, 52oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút, cuối cùng là bước kéo dài tại 72oC trong 15 phút.
3. So sánh đặc điểm hình thái lồi A. fuciphagus thu tại đảo A2-Hòn Mun và 155-
Thống Nhất-Nha Trang với các lồi trên thế giới khơng có gì khác biệt lắm. Về