3.2.1 Kiểm tra DNA tổng số
Trong nghiên cứu này, đã sử dụng 2 phương pháp tách chiết DNA tổng số cho 18 cá thể chim yến (dung dịch Chelex 10% đối với mẫu mô cơ) và 63 cá thể chim yến ( bộ kit MagaZorb đối với mẫu lông). Sau đó điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose. Kết quả điện di được trình bày ở hình 3.1.
Qua hình 3.1 từ mẫu số 5 đến mẫu số 7 đều xuất hiện các băng sáng đậm rõ nét, chứng tỏ đã tách chiết được DNA các mẫu mô cơ chim yến và nồng độ DNA tổng số là nhiều.
Hình 3.1: Hình ảnh điện di DNA tổng số của chim yến
Kí hiệu: 1, 2, 3: mẫu DNA chim yến tách chiết từ lông; 4, 5, 6, 7: mẫu DNA tách chiết từ mô cơ; MK: thang marker.
Các mẫu 1 đến 4 không xuất hiện các băng là do nồng độ DNA tổng số tách chiết từ lông quá ít hoặc không có. Đối với những mẫu này cần thử nghiệm khuếch đại gen trực tiếp mà không qua bước kiểm tra nồng độ DNA tổng số.
Chính vì vậy mà khi khuếch đại gen Cytb mtDNA bằng kĩ thuật PCR đối với mẫu lông thì lượng DNA mẫu đưa vào là 10µl nhiều hơn so với lượng DNA mẫu mô cơ là 1µl.
3.2.2 Xây dựng chƣơng trình PCR khuếch đại trình tự gen Cytb DNA ty thể
3.2.2.1 Thiết kế mồi và kiểm tra đặc tính của mồi trên lý thuyết
Cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 được thiết kế để khuếch đại đoạn trình tự có kích thước 500bp và cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2 khuếch đại đoạn trình tự có kích thước 700bp [16], [48].
Các đặc tính của mồi bao gồm: kích thước, nhiệt độ biến tính, tỷ lệ GC, cấu trúc cặp tóc… được kiểm tra bằng phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer 3.0
Bảng 3.1: Các đặc tính của mồi
Tên mồi Độ dài
Nhiệt độ biến tính (Tm, oC) Thành phần GC (%) Seldf- dimer G (Kcal/mol) Hetero- dimer G (Kcal/mol) Cytb FW1 20 53,5 50 -3,17 Cytb RV1 18 53,6 50 -4,16 -6,14 Cytb RV2 21 53,1 33,3 -8,31 -5,24
Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy rằng:
Về kích thước: cặp mồi có chiều dài đạt yêu cầu (18-25bp) cho phép khả năng nhân bản tốt nhất.
Về nhiệt độ biến tính: sự chênh lệch nhiệt độ biến tính giữa mồi xuôi và mồi ngược không lớn, dao động trong khả năng cho phép, đảm bảo cho khả năng bắt cặp tốt nhất của chúng trong cùng điều kiện nhiệt độ.
Về thành phần GC: do đoạn gen khảo sát nằm trong vùng có % GC không cao, nên tỷ lệ GC của mỗi cặp mồi cũng không cao. Theo Desjardins và Morais thì trình tự Cytb RV2 cho kết quả phân tích mồi không tốt nên chúng tôi đã thiết kế mồi Cytb RV1 (mồi Cytb RV1 có %GC nằm trong khoảng tỷ lệ tốt nhất cho sự khuếch đại của mồi 40-60%) [16], [48]). Tuy nhiên theo thực nghiệm, mặc dùng % GC không cao nhưng Cytb RV2 vẫn khuếch đại sản phẩm tốt
Kết quả kiểm tra sự tạo thành cấu trúc thứ cấp của các mồi cho thấy:
Các mồi đều có sự tạo thành cấu trúc cặp tóc (hairpin) và cấu trúc tự mồi (self-dimer). Tuy nhiên, các cấu trúc này đều có năng lượng tự do lớn hơn -9 kcal/mole (thường thì các cấu trúc thứ cấp có lớn hơn -9kcal/mol sẽ không gây ảnh hưởng đến hoạt động của mồi) (Hình 3.2).
Hình 3.2: Cấu trúc kẹp tóc của mồi: a) mồi Cytb RV1; b) mồi Cytb RV2
Qua khảo sát nhận thấy giữa mồi xuôi và mồi ngược có hình thành cấu trúc hetero- dimer với nhau, tuy nhiên tấc cả các cấu trúc này đều có lớn hơn -9 kcal/mole.
3.2.2.2Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện phản ứng PCR a) Khảo sát nồng độ cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2 a) Khảo sát nồng độ cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2
Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng PCR theo dải nồng độ từ: 0,25 µl; 0,5µl; 0,75µl; 1µl; 1,25µl; 1,5µl còn các thành phần khác và chu trình nhiệt của phản ứng không đổi.
Hình 3.3: Kết quả khảo sát nồng độ cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2
Trong đó, mẫu 1 đến mẫu 6: nồng độ cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 theo thứ tự: 0,25 µl; 0,5µl; 0,75µl; 1µl; 1,25µl; 1,5µl; mẫu 7 đến mẫu 12 nồng độ cặp mồi
Cytb FW1/Cytb RV2 theo thứ tự: 0,25 µl; 0,5µl; 0,75µl; 1µl; 1,25µl; 1,5µl; MK: thang DNA.
Từ hình 3.3 ta thấy, đối với cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1: mẫu 1, 2 nồng độ mồi quá thấp không xuất hiện băng, mẫu 3 tại nồng độ mồi 0,75µl đã xuất hiện băng 500bp mờ, đến nồng độ 1µl trở đi băng ở 500bp đậm nét hơn. Tuy nhiên để tiết kiệm hóa chất chúng tôi chọn nồng độ mồi Cytb FW1/Cytb RV1cho phản ứng là 1µl; đối với cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2 thì các mẫu 7 không cho băng, mẫu 8 xuất hiện băng 700bp mờ ở nồng độ mồi 0,5µl, đến mẫu 9 trở đi băng ở 700bp đậm nét hơn nhưng để cho phản ứng tối ưu nhất chúng tôi dùng nồng độ 0,75µl ở mẫu 9. Như vậy, nồng độ cho cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2 được chọn là 0,75µl.
b) Khảo sát nhiệt độ lai của 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2
Chúng tôi chọn mẫu DNA tách chiết tổng số từ mô cơ có chất lượng tốt nhất (cho băng điện di đậm nhất) với nồng độ tối ưu ở mỗi cặp mồi và các thành phần khác của phản ứng PCR là không đổi để khảo sát nhiệt độ lai của 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2.
Sau khi tiến hành các thí nghiệm PCR khảo sát nhiệt độ lai của 2 cặp mồi trên theo thứ tự: 51oC, 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC chúng tôi thu được kết quả như sau: tại tấc cả các nhiệt độ khảo sát mồi bắt cặp với DNA khuôn với mức độ hiệu quả khác nhau, tuy nhiên mẫu số 4 ở 54oC cho băng sáng và rõ nhất. Tại 54oC mồi bắt cặp với DNA khuôn tốt nhất do đó chúng tôi chọn 54oC là nhiệt độ lai tối ưu cho cả 2 cặp mồi (Hình 3.4).
a) Cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1; b) Cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2
Trong đó: mẫu 1: 51oC; mẫu 2: 52oC; mẫu 3: 53oC; mẫu 4: 54oC; mẫu 5: 55oC; mẫu 6: 56oC; mẫu 7: 57oC; Mk: thang DNA 1000bp
c) Khảo sát nồng độ DNA tổng số đối với mẫu lông cho phản ứng PCR
Theo kết quả ở mục III.2: mẫu lông rất khó tách chiết nên nồng độ DNA rất thấp hoặc không có, do đó chúng tôi thực hiện các thí nghiệm trên dải nồng độ DNA tổng số mẫu lông từ: 4 µl, 6 µl, 8 µl, 10 µl, 12 µl, 14 µl. Trừ sự thay đổi về nồng độ DNA các thành phần khác và điều kiện phản ứng PCR được giữ nguyên và đồng nhất.
Hình 3.5: Kết quả khảo sát nồng độ DNA từ mẫu lông chim
a) cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1; MK: thang DNA 1000bp. b) cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2; MK: thang DNA 3000bp
Trong đó: mẫu 1 đến 6 tương ứng với các nồng độ DNA 4 µl, 6 µl, 8 µl, 10 µl, 12 µl, 14 µl
Từ hình 3.5 cho thấy các mẫu 1 không cho băng vì nồng độ DNA quá thấp không đủ thực hiện phản ứng PCR. Các mẫu còn lại đều xuất hiện băng ở mức độ đậm nhạt khác nhau, trong đó mẫu 4 ở nồng độ DNA tổng số là 10µl cho băng đậm rõ nét nhất. Do đó, tại nồng độ DNA tổng số tách chiết từ lông chim 10µl là nồng độ tối ưu cho cả 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2.
3.2.3 Giải trình tự DNA chim yến
Sản phẩm PCR của đoạn gen Cytb DNA ty thể tiếp tục được tinh sạch bằng bộ kit của hãng Promega phục vụ cho việc giải trình tự trực tiếp. Dữ liệu giải mã DNA được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng. Kết quả, chúng tôi đã giải trình tự DNA của 20 mẫu chim yến A. fuciphagus.
Sử dụng các trình tự này chúng tôi đã xây dựng được cây đa dạng loài A. fuciphagus ở các vùng địa lý tại Khánh Hòa dựa trên trình tự gen Cytb mtDNA.
3.2.4 Đa dạng di truyền A. fuciphagus 3.2.4.1 Đa dạng haplotype 3.2.4.1 Đa dạng haplotype
Sau khi so sánh, dóng hàng, phân tích trình tự Cytb mtDNA 514bp của 11 cá thể chim yến A. fuciphagus ở đảo A2-Hòn Mun-Khánh Hòa (được kí hiệu là: Y1- NT-A2, Y3-NT-A2, Y8-NT-A2, Y9-NT-A2, Y11-NT-A2, Y14-NT-A2, Y15-NT- A2, Y16-NT-A2, Y17-NT-A2, Y18-NT-A2, Y21-NT-A2), thu được: tổng số haplotype (k) = 2 với đa dạng haplotype là h = 0,167 ± 0,134, đa dạng nucleotide = 0,00270 và số lượng vị trí đa hình (polymorphic sites) là s = 9, số đột biến Eta = 9, sự khác biệt trình tự là 1,5%.
Phân tích trình tự Cytb mtDNA 514bp của 8 cá thể chim yến A. fuciphagus ở 155-Thống Nhất-Nha Trang (kí hiệu là: Y2-NT-155TN, Y4-NT-155TN, Y5-NT- 155TN, Y6-NT-155TN, Y7-NT-155TN, Y10-NT-155TN, Y12-NT-155TN, Y13- NT-155TN), thu được: tổng số haplotype (k) = 3 với đa dạng haplotype là h = 0,464±0,200, đa dạng nucleotide = 0,0009 và số lượng vị trí đa hình (polymorphic sites) là s = 2, số đột biến Eta = 2, sự khác biệt trình tự là 0,5%.
Phân tích trình tự Cytb mtDNA 514bp của 19 cá thể A. fuciphagus cả Khánh Hòa (11 cá thể ở A2-Hòn Mun và 8 cá thể ở 155-Thống Nhất), thu được: tổng số haplotype (k) = 4 với đa dạng haplotype là h = 0,591±0,088, đa dạng nucleotide = 0,00131 và số lượng vị trí đa hình (polymorphic sites) là s = 3, số đột biến Eta = 3, sự khác biệt trình tự là 0,725%.
Phân tích trình tự Cytb mtDNA 514bp của 29 cá thể A. fuciphagus ở Việt
Nam (19 cá thể ở Khánh Hòa, 1 cá thể ở Trảng Bom-Đồng Nai và 9 lấy từ Genbank), thu được: tổng số haplotype (k) = 3 với đa dạng haplotype là h = 0,135±0,085 đa dạng nucleotide = 0,00225 ± 0,00156 và số lượng vị trí đa hình (polymorphic sites) là s = 6, số đột biến Eta = 6, sự khác biệt trình tự là 0,478%
Tuy nhiên, sau khi so sánh và dóng hàng thì trình tự Cytb mtDNA của 65 cá thể Aerodramus spp. (20 cá thể từ nghiên cứu hiện tại và 45 lấy từ Genbank) chỉ còn 214bp được sử dụng cho phân tích haplotype, thu được: tổng số haplotype (k) = 19 với đa dạng haplotype là h = 0,743±0,043, đa dạng nucleotide = 0,0307±0,0063 và số lượng vị trí đa hình (polyphormic sites) là s = 66, số đột biến Eta = 86, sự khác biệt trình tự là 6,4817%.
Các giá trị phân tích Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus spp. được biểu hiện ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Các giá trị phân tích Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus spp
Vùng thu mẫu N s
Đa dạng di truyền
k Eta H
155-Thống Nhất-Nha
Trang 8 2 3 2 0,464±0,200 0,0009
Đảo A2-Hòn Mun-
Nha Trang 11 9 2 9 0,167±0,134 0,00270 155-Thống Nhất và
Đảo A2-Hòn Mun 19 3 4 3 0,591±0,088 0,00131 Việt Nam (Đặng và
CS, 2011) 9 2 2 2 0,222±0,0276 0,0021 Nghiên cứu hiện tại và
Việt Nam 29 6 3 6 0,135±0,085 0,00225 Thái Lan 10 1 2 1 0,2±0,02376 0,00094 Malaysia và Sumatra 10 9 6 9 0,844±0,103 0,01006 Thế giới 65 66 19 86 0,743±0,043 0,0307
3.2.4.2 Đa dạng di truyền
Quần thể A. fuciphagus tại 2 vùng địa lý ở Khánh Hòa cho thấy đa dạng di
truyền ở mức độ trung bình (4 haplotype/19 cá thể) với sự khác biệt trình tự trung bình là 0,725%. Trong đó 2 haplotype/11 cá thể tại đảo A2 Hòn Mun, sự khác biệt trình tự là 0,2÷2,6% (có những cặp cá thể cho giá trị tương đồng rất cao như: Y3- Y8_A2; Y8-Y9_A2; Y18-Y14_A2, những cá thể khác lại cho sự khác biệt trình tự lên đến 10,1±12,7%); 3 haplotype/8 cá thể tại 155-Thống Nhất trình tự khác biệt khá cao 2.2÷66,8%, nhưng giữa Y4-155TN và Y12-155TN có sự tương đồng khá cao và sự khác biệt trình tự là thấp nhất trong quần thể yến nhà 0,6%. Sự khác biệt trình tự của chim yến A. fuciphagus tại Khánh Hòa được thể hiện chi tiết ở bảng
3.3, bảng 3.4, bảng 3.5
Sự khác biệt trình tự của quần thể A. fuciphagus tại Thái Lan là khoảng 0,2% Sự khác biệt trình tự của quần thể A. fuciphagus tại Malaysia và Sumatra là
khoảng 2,13%
Bảng 3.3: Giá trị tương đồng (%) của các haplotype trình tự Cytb mtDNA
của chim yến A. fuciphagus thu tại Khánh Hòa, Việt Nam
Bảng 3.4: Giá trị tương đồng và giá trị khác biệt (%) của các haplotype trình tự
Cytb mtDNA của A. fuciphagus thu tại đảo A2-Hòn Mun-Nha Trang
Bảng 3.5: Giá trị tương đồng và giá trị khác biệt (%) của các haplotype trình tự
3.2.5 Đa dạng di truyền quần thể chim yến A. fuciphagus
Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự gen Cytb mtDNA của 22 cá thể của
A. fuciphagus (20 cá thể từ nghiên cứu hiện tại gồm 19 cá thể yến đảo và yến nhà ở
Khánh Hòa; 1 cá thể ở Đồng Nai và 2 cá thể từ nhóm ngoại trên Genbank) dựa trên 3 phương pháp MP, ML, NJ cho kết quả tương tự về cây đa dạng di truyền loài chim yến A. fuciphagus (Hình 3.7). Giá trị bootstrap (BT) và giá trị tin cậy (PP) của thuật toán MP, ML và NJ được biểu hiện trên các nhánh.
Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài yến ở Việt Nam với các loài trên thế giới, chúng tôi đã phân tích sử dụng trình tự Cytb mtDNA của 19 haplotype của loài chim yến Aerodramus spp. (từ nghiên cứu hiện tại và từ Genbank). Loài Apus apus và Amazilia tzacatl được sử dụng làm nhóm ngoại. Khi so sánh và dóng hàng các trình tự gen này, chỉ có 214 bp được sử dụng cho phân tích di truyền. Trong đó 149 nucleotide không đổi (characters are constant); 40 nucleotide không mang thông tin (veriable characters are parsimony uninformative) và 25 nucleotide có mang thông tin (parsimony informative). Mô hình tối ưu là TrN+I với tần số các base nitơ là A= 0,3080; C= 0,4077; G= 0,0808; T= 0,2035 (Bảng 2.4)
Hình 3.6: Cây đa dạng loài dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến
Aerodramus fuciphagus xây dựng theo phương pháp maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và Neighbor Joining (NJ).
Kết quả được trình bày ở Hình 3.8 với cây đa dạng di truyền thu được từ phân tích MP, ML giá trị bootstrap (BT) và giá trị tin cậy (PP) của thuật toán MP, ML được biểu hiện trên các nhánh. Đối với thuật toán MP, cây đa dạng loài với 101 bước (Consistency index (CI) = 0,8416; Homoplasy index (HI) =0,1584; chỉ số thay đổi tỷ lệ nhất quán (Rescalted consistency index_RC) = 0,7707; chỉ số duy trì (Retention index_RI)= 0,9158).
Phương pháp ML cho kết quả cây phân loài khá rõ ràng, yến đảo và yến nhà ở Khánh Hòa phân thành 2 nhóm riêng biệt, kiểm tra các trình tự tương đồng của 2 nhóm này trên BLAST chúng tôi tạm gọi nhóm yến đảo và yến nhà là loài A. fuciphagus nhưng chúng cùng nằm trong nhóm yến của Việt Nam đã được Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Hà Nội định danh đến phân loài A. f. germane.
Nhóm A. fuciphagus tại Việt Nam lại có mối quan hệ gần gũi với các loài A. salangana, A. francicus, A. elaphrus ở USA (giá trị bootstrap 56/100). Các nhóm
yến A. fuciphagus lấy từ Thái Lan, Malaysia và Sumatra, Hồng Kông, Hà Lan tách hẳn ra một nhánh riêng, là nhánh có quan hệ gần gũi với các loài ở Việt Nam (giá trị bootstrap 46/100). Cá thể yến thu ở Trảng Bom-Đồng Nai xếp chung với các loài A.
fuciphagus ở Thái Lan, Malaysia_Sumatra và Hồng Kông. Mặc khác, khi tìm kiếm
các trình tự tương đồng trên BLAST của trình tự yến ở Trảng Bom- Đồng Nai cho kết quả đến phân loài là A. f. vestitus. Chi Hydrochous gigas là trung gian giữa A. fuciphagus (bộ lông nhẵn bóng, có định vị bằng tiếng vang) với loài A. maximus (bộ
lông khô khốc, không định vị bằng tiếng vang) được thể hiện rõ trên cây phân loài, điều này giống với kết quả nghiên cứu của Brooke [11].
Hình 3.7: Cây đa dạng loài dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến A. fuciphagus thu tại Khánh Hòa, Việt Nam và một số khu vực khác trên thế giới; Apus apus và