Chƣơng II : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.5 Xử lý số liệu xây dựng cây phát sinh loài
a) Phân tích sự đa dạng của chim yến:
Trình tự cho mỗi locus liên kết, chỉnh sửa, và loại bỏ đi đoạn mồi để có chiều dài chung bằng cách sử dụng phần mềm lắp ráp trình tự DNA và phân tích GENEIOUS PRO 5.5 [19]. Trình tự đã được xử lý sẽ được nhập vào BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng [77].
b) Phân tích đa dạng di truyền chim yến (swiftlets) dựa trên haplotype:
Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể được tính bằng tổng số haplotype (k), số lượng của vị trí đa hình – polymorphic sites (s), đa dạng haplotype – haplotype diversity (d) và đa dạng nucleotide – nucleotide diversity ( số đột biến (Eta).
c) So sánh trình tự của chim yến
Sự khác biệt di truyền giữa các cặp trình tự của các loài cần so sánh được tính tốn theo cơng thức:
d) Phân tích mối quan hệ phát sinh lồi (phylogenetic analysis):
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen Cytb mtDNA của chim yến thu tại Nha Trang, Đồng Nai từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2012 bao
gồm: 65 trình tự, trong đó có 20 trình tự từ nghiên cứu hiện tại (11 trình tự từ yến đảo, 8 trình tự từ yến nhà ở Khánh Hịa và 1 trình tự từ Đồng Nai) và 45 trình tự từ Genbank.
Thơng tin về các trình tự, mã số gen của các lồi chim yến được trình bày ở bảng 2.3. Trình tự của 2 lồi chim yến Apus apus (JQ353928) và Amazilia tzacatl (U89180) từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại trong tấc cả các phân tích [43], [62].
Bảng 2.3: Trình tự gen Cytb mtDNA của chim yến sử dụng trong nghiên cứu này
Loài Mã số gen Nơi thu mẫu Tài liệu tham khảo
A. salangana AY294424 USA Price và CS, 2004
A. elaphrus AY294430 USA Price và CS, 2004
A. francicus AY294433 USA Price và CS, 2004
Hydrochous gigas AY135625 Hà Lan Thomassen và CS, 2003
A. fuciphagus AY135631 AY135632 Hà Lan Thomassen và CS, 2003 A. fuciphagus EU072052 EU072054 EU072055 EU072061 EU072064 EU085131 EU085129 EU085127
EU085125 EU085123 A. fuciphagus JF269226 JF269227 JF2 69228 JF269229 JF2 69230 JF269231 JF2 69232 JF269233 JF269234 JF269236 Malaysia và Sumatra Goh và CS, 2011 A. fuciphagus HM626165
HM626164 Trung Quốc Chow và CS, 2010
A. fuciphagus
Xxx (20
trình tự) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại
A. f. germani
JN709907
JN709908 JN709909
JN709910 JN709912 JN709914 JN709916 JN709918 JN709920 A. maximus JQ353846 JQ353847 Đức Packert và CS, 2012 A. brevirostris JQ353850 JQ353848 Đức Packert và CS, 2012 A. terraereginae AY294453
AY294451 USA Price và CS. 2004
Apus apus JQ353938 Đức Mol và CS, 2012
Amazilia tzacatl U89180 USA Mol và CS, 2000
e) Phân tích di truyền quần thể lồi Aerodramus fuciphagus
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen Cytb mtDNA của chim yến cho tổ trắng ăn được thu tại 155 Thống Nhất và Đảo Hòn Mun (Nha Trang), Trảng Bom-Đồng Nai từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2012 bao gồm 65 trình tự trong đó có 20 trình tự Cytb mtDNA của A. fuciphagus từ nghiên cứu hiện tại và 45 trình tự Cytb mtDNA của Aerodramus từ Genbank. Trình tự của 2 lồi chim yến
Apus apus (JQ353928) và Amazilia tzacatl (U89180) từ Genbank được sử dụng làm
nhóm ngoại trong phân tích mối quan hệ lồi bằng cây tiến hóa.
Phân tích mối quan hệ lồi bằng cây tiến hóa và đa dạng di truyền chim yến được tiến hành dựa trên 3 thuật toán maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và Neighbor-Joining (NJ). Khi tiến hành xây dựng cây phát sinh lồi trong quần thể ở Nha Trang–Khánh Hịa, chúng tôi sử dụng phần mềm Mega phiên bản 5.0 [40] với cả 3 thuật toán MP, ML và NJ. Tuy nhiên khi tiến hành phân tích cây phát sinh lồi của loài chim yến từ Việt Nam với các loài khác trên thế giới, chúng tôi tiến hành phương pháp MP và NJ trên phần mềm Mega phiên bản 5.0 [40] và phương pháp ML bằng phần mềm PAUP 4.0 [73] và MyBayes 3.1.2 [33].
Đối với thuật toán MP, 1000 độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng. Tuy nhiên, đối với thuật tốn ML, độ lặp lại là 100 vì thời gian chạy thuật toán này khá lâu. Trước khi tiến hành thuật tốn ML các mơ hình tiến hóa được kiểm tra bằng phần mềm Modeltest 3.7 [61]. Các thơng số của q trình phân tích các trình tự và mơ hình tiến hóa (best-fit-model) của phân tích di truyền quần thể A. fuciphagus được
lựa chọn bởi phần mềm Modeltest 3.7, sử dụng tính năng Akaike Information Criterion được trình bày ở bảng 2.4
Giá trị boostrap (BT) được tính tốn để xác định tính chính xác của thuật toán MP với độ lặp lại 100. Do sự hạn hẹp về thời gian và số lượng trình tự quá lớn, phương pháp successive approximation approach được áp dụng đối với thuật toán ML [72], xác định cây tiến hóa dựa trên mơ hình tiến hóa, so sánh kết quả thu được với phương pháp phân tích MP. Cây đa dạng lồi được biểu hiện và hiệu chỉnh bằng phần mềm TreeView 1.6.6 [57].
Các trình tự được dóng hàng bằng cách sử dụng phần mềm Mega phiên bản 5.0 [40]. Phần mềm DnaSP phiên bản 4.0 được sử dụng để xác định các haplotype [66] và ước tính đa dạng di truyền trong quần thể haplotype (h) và sự đa dạng nucleotide (π) [52].
Bảng 2.4: Các thơng số của q trình phân tích các trình tự và mơ hình tiến hóa
(best-fit-model) giữa chim yến Việt Nam với chim yến của thế giới
Thông số Dữ liệu gen Cytb mtDNA
Tổng số trình tự 66
Tổng số nucleotide dóng hàng 214 Vị trí khơng đổi (Constant sites) 149 Vị trí không mang thông tin
(Parsimony uninformative) 40 Vị trí mang thơng tin
(Parsimony informative ) 25
Mơ hình tiến hóa (Best-fit-model) TrN+I Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide
equilibrium) Frequency µ (A, C, G, T)
fA(0.3080), fC(0.4077), fG(0.0808), fT(0,2035)