Tách chiết DNA tổng số

Một phần của tài liệu Nghiên cứu đa dạng di truyền của chim yến (aerodramus spp ) ở khánh hòa dựa trên chỉ thị phân tử cytochrome b của DNA ty thể (Trang 41 - 42)

Chƣơng II : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số

a) Tách chiết DNA từ mẫu mô cơ

DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể chim yến con (thu mẫu trực tiếp từ công nhân của cơng ty Yến Sào Khánh Hịa, giữ mẫu trong đá băng, sau đó được bảo quản ở -70oC) bằng dung dịch 10% Chelex [76]:

Dùng panh và kéo vô trùng cắt một mẩu nhỏ khoảng 0,2cm2 mẫu mô cơ rồi cho vào 300µl dung dịch chelex 10% (Cân 5g chelex vào 50ml nước sạch. Sau đó đặt cốc dung dich chelex lên máy khuấy từ, vừa khuấy vừa hút 300µl cho vào ống eppendorf 1ml) tồn bộ mẫu phải nằm trong lớp chứa Chelex. Sau đó ủ mẫu trên block nhiệt ở 95oC trong 5-6 giờ. Lấy ra vortex kĩ hỗn hợp trong 30 giây, rồi ly tâm lạnh 5000 vòng trong 5 phút. Sau cùng hút dịch nổi huyền phù sang ống eppendorf mới, DNA thu được sẽ được bảo quản trong tủ đông -40oC.

b) Tách chiết DNA từ mẫu lông

DNA được tách chiết từ mẫu lông của từng cá thể chim yến bằng bộ kit MagaZorb DNA Mini-Prep Kit (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thực hiện quy trình sản xuất theo các bước sau:

Lấy 2÷4 mẫu lơng bụng chim yến cho vào ống eppendorf 1,5ml đã khử trùng. Dùng kéo nhọn cắt thật nhỏ các lông chim và đẩy dồn phần mẫu xuống đáy của ống để tạo điều kiện thuận lợi cho q trình thủy phân sau này. Sau đó thêm 20µl dung dịch protein K vào. Đem vortex trong 15 giây. Tiếp đến hút 200µl Lysis Buffer cho vào ống tube. Vortex nhẹ đến khi hỗn hợp dung dịch mẫu/protein K/Lysis Buffer đồng nhất, thường là 15 giây. Ủ ống mẫu trên block nhiệt trong 16 giờ ÷24 giờ ở 56oC.

Thêm 500µl dung dịch Binding Buffer đã được vortex nhẹ cho vào ống mẫu. Vortex nhẹ cho đến khi hỗn hợp đồng nhất, thường là 15 giây. Thêm 20µl thuốc thử MagaZorb trực tiếp vào dung dịch, vortex nhẹ trong 15 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, vừa ủ vừa lật úp tube đảm bảo dung dịch được trộn đều. Lắng đọng trầm tích các hạt MagaZorb bằng cách sử dụng một rack từ, khoảng 4-5 phút. Sau

đó đảo ngược nam châm 2-3 lần để “rửa” sạch nắp ống với các nỗi trên mặt. Cẩn thận hút bỏ chất lỏng, càng nhiều càng tốt, khơng để loại bỏ bất kì hạt nào.

Thêm 1ml dung dịch đệm rửa vào tube. Sau đó nghịch đảo tube vài lần cho các hạt phân tán hoàn toàn. Cặn lắng các hạt trên rack từ, giống bước trên. Loại bỏ dịch nổi, chất lỏng. Lặp lại bước rửa 1-2 lần nữa. Sau đó ly tâm khơ, để loại bỏ hồn tồn dịch lỏng.

Thêm 100µl dung dịch đệm rửa giải cho vào tube. Ủ tube trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, vừa ủ vừa nghịch đảo tube. Cặn lắng các hạt trên rack từ. Cẩn thận hút dịch nổi, tránh hút các hạt sang tube sạch mới. Tube mới chứa DNA đã được tách chiết tổng lượng là 100µl, sau đó bảo quản ở -20oC cho các phân tích tiếp theo.

Một phần của tài liệu Nghiên cứu đa dạng di truyền của chim yến (aerodramus spp ) ở khánh hòa dựa trên chỉ thị phân tử cytochrome b của DNA ty thể (Trang 41 - 42)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(79 trang)