Chƣơng II : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.4Giải trình tự
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.4Giải trình tự
a) Nguyên tắc:
Giải trình tự của gen là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide, đó là A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine) trên phân tử DNA.
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này được xác định rõ. Chuyển các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vikhuẩn để nhân bản các vector thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng giới hạn các nucleotide tận (ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, G, C), phản ứng được thực hiện trong 4 ống và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, enzyme DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc.
Để thực hiện giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer) thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chum tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA cần giải trình tự.
b) Tiến hành:
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ “Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem” của Promega theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye® Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi Cytb FW1, Cytb RV1 và Cytb RV2 tương tự như phản ứng PCR, theo chương trình nhiệt như sau: 96oC trong 20 giây, 50oC trong 20 giây và 60oC trong 4 phút.
Sản phẩm phản ứng được phân tích trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism® 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems). Các trình tự được kết nối bằng kỹ thuật Contig Express trong phần mềm package Vector NTI v.9.