a) Khảo sát nồng độ cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2
Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng PCR theo dải nồng độ từ: 0,25 µl; 0,5µl; 0,75µl; 1µl; 1,25µl; 1,5µl còn các thành phần khác và chu trình nhiệt của phản ứng không đổi.
Hình 3.3: Kết quả khảo sát nồng độ cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2
Trong đó, mẫu 1 đến mẫu 6: nồng độ cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 theo thứ tự: 0,25 µl; 0,5µl; 0,75µl; 1µl; 1,25µl; 1,5µl; mẫu 7 đến mẫu 12 nồng độ cặp mồi
Cytb FW1/Cytb RV2 theo thứ tự: 0,25 µl; 0,5µl; 0,75µl; 1µl; 1,25µl; 1,5µl; MK: thang DNA.
Từ hình 3.3 ta thấy, đối với cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1: mẫu 1, 2 nồng độ mồi quá thấp không xuất hiện băng, mẫu 3 tại nồng độ mồi 0,75µl đã xuất hiện băng 500bp mờ, đến nồng độ 1µl trở đi băng ở 500bp đậm nét hơn. Tuy nhiên để tiết kiệm hóa chất chúng tôi chọn nồng độ mồi Cytb FW1/Cytb RV1cho phản ứng là 1µl; đối với cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2 thì các mẫu 7 không cho băng, mẫu 8 xuất hiện băng 700bp mờ ở nồng độ mồi 0,5µl, đến mẫu 9 trở đi băng ở 700bp đậm nét hơn nhưng để cho phản ứng tối ưu nhất chúng tôi dùng nồng độ 0,75µl ở mẫu 9. Như vậy, nồng độ cho cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2 được chọn là 0,75µl.
b) Khảo sát nhiệt độ lai của 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2
Chúng tôi chọn mẫu DNA tách chiết tổng số từ mô cơ có chất lượng tốt nhất (cho băng điện di đậm nhất) với nồng độ tối ưu ở mỗi cặp mồi và các thành phần khác của phản ứng PCR là không đổi để khảo sát nhiệt độ lai của 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2.
Sau khi tiến hành các thí nghiệm PCR khảo sát nhiệt độ lai của 2 cặp mồi trên theo thứ tự: 51oC, 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC chúng tôi thu được kết quả như sau: tại tấc cả các nhiệt độ khảo sát mồi bắt cặp với DNA khuôn với mức độ hiệu quả khác nhau, tuy nhiên mẫu số 4 ở 54oC cho băng sáng và rõ nhất. Tại 54oC mồi bắt cặp với DNA khuôn tốt nhất do đó chúng tôi chọn 54oC là nhiệt độ lai tối ưu cho cả 2 cặp mồi (Hình 3.4).
a) Cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1; b) Cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2
Trong đó: mẫu 1: 51oC; mẫu 2: 52oC; mẫu 3: 53oC; mẫu 4: 54oC; mẫu 5: 55oC; mẫu 6: 56oC; mẫu 7: 57oC; Mk: thang DNA 1000bp
c) Khảo sát nồng độ DNA tổng số đối với mẫu lông cho phản ứng PCR
Theo kết quả ở mục III.2: mẫu lông rất khó tách chiết nên nồng độ DNA rất thấp hoặc không có, do đó chúng tôi thực hiện các thí nghiệm trên dải nồng độ DNA tổng số mẫu lông từ: 4 µl, 6 µl, 8 µl, 10 µl, 12 µl, 14 µl. Trừ sự thay đổi về nồng độ DNA các thành phần khác và điều kiện phản ứng PCR được giữ nguyên và đồng nhất.
Hình 3.5: Kết quả khảo sát nồng độ DNA từ mẫu lông chim
a) cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1; MK: thang DNA 1000bp. b) cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV2; MK: thang DNA 3000bp
Trong đó: mẫu 1 đến 6 tương ứng với các nồng độ DNA 4 µl, 6 µl, 8 µl, 10 µl, 12 µl, 14 µl
Từ hình 3.5 cho thấy các mẫu 1 không cho băng vì nồng độ DNA quá thấp không đủ thực hiện phản ứng PCR. Các mẫu còn lại đều xuất hiện băng ở mức độ đậm nhạt khác nhau, trong đó mẫu 4 ở nồng độ DNA tổng số là 10µl cho băng đậm rõ nét nhất. Do đó, tại nồng độ DNA tổng số tách chiết từ lông chim 10µl là nồng độ tối ưu cho cả 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2.