1. Gốc lông; 2. Thân lông; 3. Sợi lông; 4. Lơng tơ
Yếu tố cấu trúc chính của lơng là keratin. Xét theo chiều dài, lông là một cấu trúc bị keratin hóa từ gốc dần lên ngọn. Càng đi xa khỏi gốc thì mức độ keratin hóa càng mạnh, các tế bào mất dần DNA của mình và trở thành một chuỗi protein ở phần ngọn. Phần gốc lơng cịn chứa nhiều tế bào sống [7].
Việc sử dụng bộ lông trong tách chiết DNA đã đơn giản hóa việc lấy mẫu DNA bộ gen gia cầm, đặc biệt là khi tách chiết từ máu gặp khó khăn về kích thước và tuổi của chim [51].
1.2.2 Hệ gen ty thể (Mitochondrial DNA-mtDNA)
1.2.2.1 Cấu trúc DNA ty thể
Hệ gen ty thể là phân tử DNA trần, kép, mạch vòng nhỏ (15-20kb) gồm hai chuỗi: chuỗi nặng (H strand) giàu guanine và chuỗi nhẹ (L strand) giàu cytosine. Khác với DNA nhân, mtDNA không liên kết với protein histon, điều này làm cho mtDNA tương tự với DNA của vi khuẩn.
Hệ gen ty thể chim mang những đặc trưng của hệ gen ty thể động vật có xương sống và có độ tương đồng rất cao khi so sánh với mtDNA của lưỡng cư và động vật có vú, tức là cũng gồm hai vùng là vùng mã hóa và vùng điều khiển (D- loop). Vùng khơng mã hóa chiếm 7% mtDNA, chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng (OH) và các promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (PH và PL), khoảng 90% phần DNA khơng mã hóa của ty thể nằm trong vùng này.
Vùng mã hóa chứa 37 gen và khơng có khoảng trống giữa các gen, mã hóa cho 13 polypeptide, 2rRNA và 22 tRNA. Trong đó, chuỗi nặng chứa 12 trong 13 gen mã hóa polypeptide (trừ một tiểu phần ND6 của phức hệ I là được phiên mã tờ chuỗi nhẹ), 14 trong 22 gen tRNA và cả hai gen rRNA (12S và 16S). 13 chuỗi polypeptide được mã hóa bởi DNA ty thể là thành phần của phức hệ hơ hấp của ty thể, trong đó có 7 tiểu phần (ND1, 2, 3, 4L, 4, 5, 6) trong số 46 chuỗi polypeptide của phức hệ I (NADH dehydrogenase), 1 tiểu phần (cytochrome b-Cytb) trong số 11 chuỗi polypeptide của phức hệ III ( Phức hệ bc1), 3 tiểu phần (cytochrome oxydase- CO I, II, III) trong số 13 polypeptide của phức hệ IV (cytochrome c oxidase) và 2 tiểu phần (ATPase 6 và 8) trong số 16 polypeptide của phức hệ V (ATP synthase)
[22]. Còn tấc cả các protein khác của ty thể bao gồm cả 4 tiểu đơn vị của phức hệ II (succinate dehydrogenase), tiểu đơn vị DNA polymerase γ của ty thể, các thành phần của RNA polymerase của ty thể, yếu tố phiên mã của ty thể (mtTFA), các protein ribosome của ty thể, các yếu tố kéo dài chuỗi và các enzyme trao đổi chất của ty thể đều được mã hóa bởi DNA nhân [71].
Bộ gen ty thể của các loài chim và động vật có vú được mơ tả bởi Desjardins và Morais (1990), Mindell và CS (1998). Bộ gen của ty thể được bố trí rất hiệu quả, nó thiếu các intron, có các đoạn đệm giữa các gen nơi chứa khung đọc đôi khi gối
lên nhau. Gen tRNA được xác định bởi 1 mã kí tự amino acid. Bên ngồi vịng trịn đại diện cho chuỗi nặng (H) và bên trong vòng tròn là chuỗi nhẹ (L). Phân cực của phiên mã và chuỗi sao chép được hiển thị với các đầu mũi tên. Khi khơng có đầu mũi tên được đánh dấu gen được phiên mã từ chuỗi nặng (H) với phân cực theo chiều kim đồng hồ. Các vùng được sử dụng trong nghiên cứu được đánh dấu bằng màu xám đen tối (hình 1.10) [14], [48]
Hình 1.10: Hệ gen ty thể của các lồi chim (a, b) và động vật có vú và
Mặc dù nhiều tính năng đều giống nhau trong tấc cả các mtDNA động vật có xương sống, bộ gen gia cầm có một số khác biệt đáng chú ý:
- Đầu tiên, trình tự gen gia cầm là mới lạ so với hệ gen ty thể của động vật có vú và động vật lưỡng cư (hình 1.9). Theo chiều 5’-3’ của chuỗi nhẹ từ gen ND5 (nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 5) đến vùng D- loop là các gen Cytb, tRNAThr, tRNAPro, ND6 và tRNAGlu [16], [17], [64], trong khi ở các động vật khác, gen Cytb lại nằm gần hơn với vùng điều khiển. Sắp xếp này có thể đã phát sinh do nhân bản thơng qua sự trượt sao chép kế tiếp bởi ít nhất hai sự kiện xóa độc lập [64].
- Thứ hai, một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữa hai gen tRNACys và tRNAAsn đều có ở tấc cả động vật có xương sống đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gia cầm khơng có đặc điểm này [16], [17].
- Thứ ba, gen COI (cytochrome oxydase I) có mã khởi đầu là GTG thay vì ATG và có bằng chứng cho thấy tỷ lệ thấp của thymine tại các vị trí im lặng trong khu vực mã hóa [65].
Chức năng di truyền của ty thể có hai chức năng chủ yếu : (1) mã hóa nhiều thành phần của ty thể: hai loại rRNA, tất cả các tRNA trong ty thể và nhiều loại protein có trong thành phần của màng bên trong ty thể; (2) mã hóa cho một số protein tham gia chuỗi truyền điện tử.
1.2.2.2 Đặc điểm hệ gen ty thể (mtDNA)
- Tốc độ đột biến lớn gấp 5-10 lần so với hệ gen nhân [10]. - Số lượng bản sao lớn [37], [53], [67].
- Đơn bội, hầu như khơng có sự tái tổ hợp [28], [53], [70].
- Di truyền theo dịng mẹ ở phần lớn các lồi [12], [28], [37], [53].
Phân tử DNA ty thể có tốc độ đột biến nhanh hơn 5-10 lần so với các gen nhân do cơ chế sửa chữa tái bản DNA khơng hiệu quả do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các lồi mà cịn cả trong một lồi. Bên cạnh đó, các biến dị này khơng giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế
bào khác nhau. Do đó, dựa vào tốc độ thay đổi nucleotide có thể xác định thời gian tiến hóa, xác lập đồng hồ phân tử. DNA ty thể có đặc điểm đơn bội, khơng tái tổ hợp, di truyền theo dịng mẹ, điều đó có nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ DNA ty thể thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dịng mẹ. Thêm vào đó DNA ty thể tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào. Các đặc điểm trên cùng với việc DNA ty thể bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng [34], nên sử dụng DNA ty thể như là một cơng cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong lồi và giữa các lồi có nhiều thuận lợi [24], [50], [56].
Đáng chú ý là trật tự sắp xếp của các gen trong phân tử DNA dạng vịng có thể khơng giống nhau giữa các lồi, điều này được thể hiện rõ khi so sánh trình tự bộ gen ty thể các taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các đặc điểm về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng được sử dụng như một dấu hiệu phân loại đối với các taxon bậc cao [48].
1.2.2.3 Cytochrome b
Cytochrome b là một trong những cytochrome tham gia vào quá trình vận chuyển electron trong chuỗi hô hấp của ty thể. Cytochrome b chứa 8 xoắn màng kết nối bởi vùng intramembrane hoặc extramembrane (hình 1.11) [20]. Cytochrome b chỉ được mã hóa bởi DNA ty thể.
Hình 1.11: Cấu trúc của protein cytochrome b [20]
Cytochrome b là gen được sử dụng rộng rãi nhất trong việc phát sinh lồi vì nhiều lí do. Mặc dù nó phát triển chậm trong điều kiện thay thế không đồng nghĩa,
tốc độ tiến hóa ở các vị trí im lặng tương đối cao [35]. Việc sử dụng rộng rãi cytochrome b đã làm cho nó như một thước đo chung mang ý nghĩa rằng có thể dễ dàng so sánh các nghiên cứu. Cytochrome b được cho là biến đủ cho câu hỏi cấp độ quẩn thể và bảo tồn đủ để làm rõ mối quan hệ phát sinh loài sâu hơn. Tuy nhiên, gen cytochrome b đang được ràng buộc với khả năng tiến hóa vì một số vùng của gen được bảo tồn nhiều hơn các gen khác do hạn chế chức năng [47]. Hầu hết các vị trí thay đổi được nằm trong các vùng mã hóa cho các khu vực xuyên màng hoặc kết thúc bằng amino-carboxy-terminal [36].
Cho đến nay, cytochrome b đã có được các nguồn phổ biến nhất của dữ liệu trình tự trong các nghiên cứu gia cầm. Mặc dù sử dụng cytochrome b có một số khó khăn, Moore và DeFilipps lập luận rằng dù sao đi nữa cũng là sự lựa chọn tốt nhất để giải quyết tương đối cho lịch sử tiến hóa gần đây [49]. Xu hướng của các lồi chim có tỷ lệ sai khác di truyền thấp ở phân lồi bậc cao so với các loại động vật có xương sống khác làm cho cytochrome b như là chỉ thị marker tốt nhất. Helm- Bychowski và Cracraft đã cung cấp ví dụ tốt về sự sai khác di truyền thấp trong một nghiên cứu phát sinh loài chim bộ Sẻ [29].
Sự sai khác di truyền gen cytochrome b cho rằng một số phân loài cần được nâng lên đến loài trong Tanager [27], và trong phân loại học của chim yến (Apodidae) dựa trên sự hiện diện hay vắng mặt của khả năng định vị bằng tiếng vang (echolocating) [41]. Các chuỗi cytochrome b được sử dụng thành cơng để xác định các nhóm phân loại ngay cả ở phân lồi, ví dụ như trong chim Uria (Uria
aalge) [23].
1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM YẾN TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM
Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể dựa trên phân tích trình tự một gen hoặc một họ gen. Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể mở rộng hơn, chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc vùng DNA khác nhau. Với những lồi có quan hệ gần, các gen hay vùng DNA có độ linh động cao (như intron, các vùng liên gen - đoạn chèn) thường hay được sử dụng. Song với các lồi có quan hệ xa thì các gen hay
vùng DNA có độ bảo thủ cao như gen mã hóa các rRNA hay một protein ty thể hoặc nhân thường được sử dụng. Để tăng độ tin cậy, các nghiên cứu hiện nay thường sử dụng kết hợp cả hai (vùng DNA có độ bảo thủ với vùng DNA có độ biến thiên cao). Hơn thế nữa, các chỉ thị ty thể cũng thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân. Các chỉ thị (marker) của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, cytochrome b, cytochrome oxydase, tRNA và một số vùng khơng mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1- trnP [26]. Tuy nhiên, sử dụng tồn bộ trình tự DNA ty thể sẽ giúp nâng cao độ phân giải và ý nghĩa thống kê so với việc sử dụng từng đoạn gen riêng lẽ.
1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới
Khi trình tự tồn bộ hệ gen ty thể gia cầm được công bố lần đầu tiên năm 1990, việc nghiên cứu DNA ty thể chim được phát triển tương đối rộng rãi với hàng trăm trình tự được đăng kí trên GenBank. Trình tự hệ gen ty thể đã được sử dụng thành công trong việc xác định đa dạng di truyền của các quần thể chim trên thế giới. Những dữ liệu này đã góp phần giúp hiểu rõ hơn về mối quan hệ di truyền giữa các loài chim. Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể được tiến hành trên một số loài thuộc Bộ Chim (Apodiformes).
Kocher và CS (1989) sử dụng kĩ thuật PCR khuếch đại đoạn DNA ty thể từ 100 loài động vật: động vật có vú, chim, lưỡng cư, cá và một số động vật không xương sống.
Patricia và CS (1996) đã xây dựng một phát sinh học độc lập bằng cách sử dụng chuỗi DNA ty thể cytochrome b từ chim yến và các loài cùng họ yến để kiểm tra độ tin cậy của những đặc điểm tập tính, hình thái, khả năng định vị bằng tiếng vang.
Phillip và CS (1998), đã tách chiết và khuếch đại chuỗi DNA từ lơng cho trình tự DNA chất lượng cao. Nghiên cứu nhằm sử dụng một đoạn trình tự DNA của gen DNA ty thể cytochrome b nơi có nhiều thay đổi và xây dựng cây phát sinh loài.
Năm 2005, Henri và CS xây dựng phát sinh loài chim yến bằng phân tích riêng biệt và kết hợp ba trình tự: ty thể 12S rRNA, Fib 7 và Cytb của 6 chim yến lớn, 2 chim yến nhỏ và một nhóm của lồi chim ruồi. Kết quả là loài Hydrochous gigas xếp gần gũi với nhánh Aerodramus và các nhóm yến tạo thành nhánh đồng
nhất (monophyletic group) [31].
Thomassen và CS (2005) nghiên cứu tiếng vang (âm thanh lách cách) của chim yến và sự xướng âm các quần thể khác nhau giữa các lồi có thể được dùng trong phát sinh loài. Nghiên cứu đã kết hợp tiếng vang lách cách của 8 loài chim yến và sự xướng âm quần thể của 27 lồi yến nhỏ khơng có âm dội và yến lớn có âm dội. Nghiên cứu dựa trên thuật toán Maximum parsimony_ MP và lập bản đồ đặc trưng để điều tra tín hiệu phát sinh lồi và các mơ hình tiến hóa của sự xướng âm chim yến. Kết quả, sự xướng âm khơng là thơng tin phát sinh lồi. Lập bản đồ đặc điểm sự xướng âm dựa trên cây MP cho thấy mơ hình phát sinh lồi khơng phù hợp [30].
Aowphol và CS (2008) nghiên cứu khảo sát mơ hình của sự khác biệt di truyền trong hai gen DNA ty thể (Cytb và ND2) và 8 chỉ thị microsatellites (lặp lại trình tự đơn giản) giữa và trong các quần đàn của A. fuciphagus từ đàn nhân tạo mới thành lập ở Thái Lan. Lấy mẫu 10 đàn chim yến làm tổ trắng dọc theo bờ biển của Vịnh Thái Lan và biển Andaman ở Thái Lan trong thời gian 2003-2006. Sự đa dạng di truyền của mtDNA là rất thấp và giá trị Phist đáng kể đã được tìm thấy giữa các cặp của đàn. Phân tích mối quan hệ haplotype khơng cho thấy cấu trúc di truyền qua phân phối mẫu. Mức độ đa dạng di truyền cho các chỉ thị microsatellites là cao, nhưng giá trị Fst là không đáng kể. Việc thiếu sự khác biệt di truyền giữa các đàn chim yến nhà có thể là kết quả của di chuyển gen cao giữa các bầy đàn và quy mô quần thể lớn. Kết quả nghiên cứu cho rằng A. fuciphagus sống nhân tạo gần đây đã thành lập đàn ở Thái Lan nên được xem là thành viên của một quần thể giao phối ngẫu nhiên. Mở ra hướng nghiên cứu mới là xác định xem sự giao phối ngẫu nhiên này là ổn định hay chỉ là kết quả tạm thời của sự phát triển số lượng các đàn. Và so
sánh với các đàn tự nhiên có thể cung cấp thơng tin về cơ chế sản xuất thiếu của cấu trúc di truyền trong các đàn yến nhà [60].
1.3.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam
Năm 1990, Nguyễn Quang Phách có nghiên cứu về hiệu quả sinh sản chim yến Hàng Collocalia fuciphagus germani Oustalet.
Năm 2009, Nguyễn Khoa Diệu Thu nghiên cứu nuôi thử nghiệm chim yến trong nhà để lấy tổ tại bán đảo Phương Mai Bình Định. Kết quả thu được một số đặc trưng sinh học phân lồi chim yến Colloccalia fuciphaga germani (hay cịn gọi là Aerodramus fuciphagus germanicus – chim Yến hơng xám, Yến hàng). Phân tích di truyền quần thể chim Yến làm tổ ở đảo (tỉnh Bình Định) và trong nhà tại tỉnh Bình Định và Khánh Hịa là các quần thể thuộc loài A. fuciphagus. Tác giả kết luận: quần thể chim yến làm tổ trên đất liền ở tỉnh Bình Định và tỉnh Khánh Hịa khơng bắt nguồn từ quần thể chim yến làm tổ trên đảo thuộc tỉnh Bình Định [6].
Đặng và CS (2011) nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể chim yến loài A. f.
germani tại Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử Cytochrome b DNA ty thể đã được
đăng lên ngân hàng dữ liệu Genbank.
1.4 TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Việc phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài dựa trên các đặc điểm hình thái (hình dạng, màu sắc, hành vi tập tính, khả năng định vị bằng tiếng vang…) đơi khi lại cho kết quả khơng chính xác, đặc biệt là đối với các lồi có mối quan hệ gần gũi vì chúng có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau. Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh lồi và xác định một cách chính xác quan hệ phát sinh chủng loại loài là điều rất cần thiết. Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể dựa trên phân tích trình tự một gen hoặc một họ gen. Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể mở rộng hơn, chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc nhiều vùng