a) Mục đích:
Nhân lên đoạn gen mong muốn (gen cytochrome b mitochondrial DNA) với số lượng nhiều.
b) Nguyên lý phản ứng
Phương pháp PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985.
Về nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ: Đầu tiên là giai đoạn biến tính ở 91oC-97oC làm biến tính mẫu DNA kép thành các chuỗi đơn; tiếp đến là giai đoạn bắt cặp mồi nhiệt độ ở 55oC-65oC, các đoạn mồi oligonucleotide ngắn gắn với các chuỗi DNA đơn; cuối cùng là kéo dài ở 68oC- 73oC, enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.
Như vậy, số lượng các bản DNA sao chép tăng lên gấp đôi ở mỗi chu kì. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Theo lý thuyết, kết quả sau n chu kì của phản ứng sẽ có 2n bản sao phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi.
c) Thiết kế mồi cho phản ứng PCR:
Trong nghiên cứu này sử dụng 2 cặp mồi Cytb FW1_Cytb RV1 và Cytb FW1_Cytb RV2 được thiết kế dựa trên tham khảo của cặp mồi ND5_Thr để nhân lên đoạn gen Cytb mtDNA chim yến (Bảng 2.2).
Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen Cytb của mtDNA
- Phương pháp đánh giá mồi:
Các thông số của mồi được kiểm tra bằng các phần mềm Oligo Analyzer, ClustalX 2.0.12, chương trình BLAST trên NCBI, cùng các trình tự bộ gen A. fuciphagus được lấy từ Genebank, cặp mồi sẽ được kiểm tra trên lý thuyết nhằm
đảm bảo các yêu cầu về kích thước, % GC, nhiệt độ biến tính, khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi, trước khi được ứng dụng vào thực nghiệm.
- Phương pháp xác định nồng độ mồi tối ưu:
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng PCR trên DNA được tách chiết từ mẫu cơ, sau đó sẽ áp dụng cho mẫu DNA tách chiết từ mẫu lông. Để xác định độ nhạy của mồi, chúng tôi tiến hành khảo sát ở các nồng độ mồi (10µM/l) khác nhau từ 0,25µl; 0,5µl; 0,75µl; 1µl; 1,25µl; 1,5µl với các điều kiện khác của phản ứng vẫn giữ nguyên. Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích 50µl gồm: 1µl khuôn DNA, 5µl 10X Dream Taq Buffer, 0,25mM mỗi loại dNTP, 2mM MgCl2, 1 đơn vị Taq polymerase (5U/1µl), nồng độ mồi được thay đổi như trên và nước cho đủ thể tích.
- Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi (Ta)
Từ nhiệt độ biến tính của mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng, tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho phản ứng theo công thức:
Gen Mồi xuôi Mồi ngƣợc
Cytb mtDNA Cytb FW1: 5’GGGGGATTCTCAGT AGACAA 3’ Tm: 53,5oC Trọng lượng phân tử (MW): 6206.1g/mole 6.4 OD260 = 31.1 nMoles Cytb RV1: 5’AGGTTGGCTACT AGGTT 3’ Tm: 53,6oC; Trọng lượng phân tử: 5585.7 g/mole 7.2OD260=39.6nMoles Cytb RV2: 5’TCTTTGGTTTAC AAACCAAT 3’ Tm: 53,1oC Trọng lượng phân tử: 6395.2 g/mole 6.3OD260=27,5nMoles
Nguồn Thomassen, H.A và CS. [74] Tự thiết kế Desjardins và Morais cùng CS, 1990 [16], [48]
Ta = (Tm primer F + Tm primer R)/ 2±5oC
Ta (annealing temperature) là nhiệt độ cho phép mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn mẫu. Ta thường chênh lệch 5 – 10oC so với Tm (melting temperature). Tm còn được gọi là nhiệt độ nóng chảy của DNA, là nhiệt độ mà tại đó một nửa số liên kết hydro nối hai mạch DNA bị phá vỡ. Mỗi mồi đều có Tm riêng tùy thuộc vào thành phần và số lượng nucleotide tạo thành mồi đó. Tương tự, mỗi mồi cũng có khoảng nhiệt độ mà ở đó chúng bắt cặp tốt nhất và đặc hiệu nhất với mạch khuôn. Do đó, để phản ứng PCR đạt hiệu quả cao cần chọn Ta gần Tm để mồi bắt cặp bổ sung hoàn toàn với mạch khuôn chứa đoạn DNA cần khuếch đại và sau phản ứng PCR chỉ thu nhận sản phẩm khuếch đại mong muốn và không có vạch kí sinh nào.
Do đó, để xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2 ở các mức nhiệt độ từ 51oC, 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC và 57oC. Trừ sự thay đổi về nhiệt độ lai, các thành phần khác và các điều kiện của phản ứng đều không đổi. Phản ứng được chạy trên chương trình gradient nhiệt độ được thiết lập trên máy PCR. Sau đó tiến hành phân tích kết quả để tìm ra nhiệt độ lai tối ưu nhất cho cả quy trình.
- Xác định nồng độ DNA khuôn đối với các mẫu DNA tách chiết từ lông chim yến.
Chúng tôi tiến hành khảo sát các nồng độ DNA tách chiết từ mẫu lông chim yến khác nhau từ 4µl; 6µl; 8µl; 10µl; 12µl; 14µl. Ứng với mỗi nồng độ trên sẽ được khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được xác định từ các thí nghiệm trên.
d) Phƣơng pháp tiến hành
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 50µl gồm: 1µl khuôn DNA đối với DNA tách chiết từ mẫu cơ hoặc 10µl khuôn DNA đối với DNA tách chiết từ mẫu lông, 5µl 10X Dream Taq Buffer, 0,25mM mỗi loại dNTP, 2µM mỗi mồi (10mM), 2mM MgCl2, 1 đơn vị Taq polymerase (5U/1µl) và nước cho đủ thể tích.
Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-Rad) theo chu trình nhiệt độ: biến tính ban đầu tại 95oC trong 3 phút; sau đó là 35 chu kỳ của 95oC trong 30 giây, 54oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút; cuối cùng là bước kéo dài
72oC trong 15 phút. Sau khi chạy PCR xong nếu chưa lấy mẫu ngay thì có thể cài đặt máy ở chế độ bảo quản mẫu 20oC (Hình 2.2).
Hình 2.2 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR