Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI TRẠI THỰC NGHIỆM LAI KHÊ, VIỆN NGHIÊN CỨU CAO SU VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD part 3 potx

46 gloeosporioides, phân biệt dễ dàng bào tử (Hình 4.4) Các mẫu nấm sau phân lập tiến hành tách đơn bào tử lame trang agar Do nấm C cassiicola khó tạo bào tử môi trường nhân tạo Nên tách đơn bào tử 11 nguồn nấm C cassiicola Để dễ dàng việc phân tích, nguồn nấm phân lập từ dvt cao su gọi tên theo dvt cao su Để dễ dàng cho việc thích chúng tơi kí hiệu tên 11 nguồn nấm theo số thứ tự từ 1- 11 (Bảng 4.1) Bảng 4.1 Danh sách nguồn nấm C cassiicola phân lập đƣợc Số thứ tự Tên nguồn nấm LH99/0019 LH99/0019 LH99/0131 LH99/0131 LH99/0431 LH99/0617 Số thứ tự 10 11 Tên nguồn nấm LH99/0679 LH99/0053 LH99/0216 LH99/067 RRIV4 Các nguồn nấm có khác biệt hình thái khuẩn lạc Tuy nhiên đặc điểm chung nguồn nấm phân lập từ dvt cao su khác khuẩn lạc có màu xám, sợi nấm mọc thành đường tròn đồng tâm Khuẩn lạc mọc dầy tụ lại Khi quan sát cách lật ngược đĩa petri nhận thấy đường trịn đồng tâm, nấm nuôi cấy lâu ngày tạo sắc tố màu đen Ở điều kiện ni cấy bình thường, nấm C cassiicola khó hình thành bào tử Hình 4.5 Khuẩn lạc nấm C cassiicola mơi trƣờng thạch đĩa PDA sau ngày nuôi cấy 47 Các dòng nấm tách dơn bào tử chuyển sang môi trường potato dextrose broth (môi trường PDA agar) lỏng để nhân sinh khối để tiếp tục nghiên cứu 4.1.2 Kết nhân sinh khối Hình 4.6 Màu sắc sợi nấm môi trƣờng PDA lỏng Bảng 4.2 Kết sau nhân sinh khối nấm C.cassiicola môi trƣờng lỏng STT Nguồn nấm Khối lượng (g) 10 11 LH99/0019 LH99/0081 LH99/0098 LH99/0131 LH99/0431 LH99/0617 LH99/0679 LH99/0053 LH99/0216 LH99/0672 RRIV4 1,05 1,34 1,32 0,89 0,95 1,1 1,47 0,96 1,24 1,15 0,98 Màu sắc môi trường (sau ngày nuôi cấy) Đen Trắng Đen Đen Đen Đen Đen Đen Đen Đen Đen Bảng 4.2 cho thấy tất nguồn nấm thí nghiệm có khả tạo sợi nấm môi trường lỏng PDA Nguồn nấm 7: LH99/0679 cho khối lượng cao với khối lượng 1,47g Nguồn nấm 4: LH99/0431 cho khối lượng thấp với khối lượng 0,89g 48 Qua q trình ni cấy cho thấy nguồn nấm có màu sắc đa dạng, thay đổi theo tuổi môi trường PDA lỏng Darussamin A Pawirosoemardjo S., 1996, nuôi nấm môi trường môi trường PDA lỏng thấy tượng tương tự Điều cho thấy giai đoạn phát triển khác tính trạng màu sắc nguồn nấm qui gen khác Cũng q trình phát triển hoạt động trao đổi chất nguồn nấm tạo chất làm đổi màu sắc nguồn nấm Tuy nhiên sau ngày nuôi nguồn nấm 2: LH99/0081 có màu trắng cịn nguồn nấm cịn lại có màu đen, nguồn nấm cho thấy độ nhớt cao Lưu ý nấm C cassiicola dễ bị nhiễm q trình ni cấy Thường nấm C cassiicola bị nhiễm sau – ngày nuôi cấy Triệu chứng nguồn nấm bị nhiễm môi trường nuôi cấy bị đục, tăng sinh khối chậm Để xác định nguồn nấm không bị nhiễm, trước thu sinh khối, dịch nuôi cấy nguồn nấm đượclàm tiêu quan sát kính hiển vi huỳnh quang 4.2 Kết ly trích Chúng tơi tiến hành ly trích DNA 11 nguồn nấm theo quy trình ly trích Lee Taylor (1990) có cải tiến (mục3.3.4.2) Sau điện di, kết thu thể thể hình 4.7: 10 11 Hình 4.4 Kết li trích DNA tổng số theo qui trình Lee Taylor (1990) có cải tiến Hình 4.7 cho thấy DNA tổng số ly trích theo quy trình mục 3.3.4.2 khơng hồn tồn Ngồi DNA tổng số cịn có đoạn DNA bị gãy trình 49 nghiền chưa tốt thao tác chưa tốt, đoạn DNA bị gãy thể thành vệt mờ chạy dọc theo giếng, xuất bên bên băng DNA tổng số Các vệt sáng cuối giếng phần tạp nhiễm q trình tinh DNA li trích chưa tốt Hơn lượng DNA tổng số ly trích khơng nhiều (30 ng) Với mục tiêu cố gắng tối ưu hóa giai đoạn để đảm bảo cho phản ứng PCR xảy tốt Nhận thấy sản phẩm ly trích cịn nhiều tạp nhiễm, lượng DNA tổng số ly trích khơng nhiều Trên sở tham khảo, phân tích thử nghiệm qui trình li trích của: Lee Taylor, 1990; David cộng 1980; Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005 Chúng tơi có số thay đổi, cải tiến qui trình li trích sau Nghiền 0,1 – 0,3 g sợi nấm làm khô kiệt nitơ lỏng Thêm 400 µl lysis buffer (phụ lục 2) vortex hỗn hợp đồng Nếu hỗn hợp đặc cho thêm lysis buffer (cho tới 700 µl) Ủ 1h 65oC Thêm thể tích tương ứng (400 µl) hỗn hợp phenol, chloroform isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1), lắc nhẹ Ly tâm phút với tốc độ 14000 vòng/phút nhiệt độ phịng Chuyển dịch (khoảng 300 µl) vào ống eppendorf Kết tủa DNA cách thêm 0,03 thể tích natri acetate 3M (6 µl) 1/2 thể tích isopropanol Trộn nhẹ nhàng Ly tâm phút (10000 vòng/phút 4oC) Loại bỏ dịch nổi, rửa phần kết tủa lần với ethanol 70% Làm khơ DNA kết tủa, hịa tan DNA với thể tích TE 1X nước (khoảng200 µl) Thêm vào l RNase vào hỗn hợp trên, trộn Ủ 370C khoảng Thêm vào l Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ phút 10 Ly tâm phút với tốc độ 14000 vòng/phút nhiệt độ phòng 11 Chuyển phần sang ống eppendorf 50 12 Kết tủa DNA cách thêm 0,03 thể tích natri acetate 3M (6 µl) 0,5 thể tích isopropanol(100 µl) Trộn nhẹ nhàng 13 Ly tâm phút (10000 vòng/phút 4oC) 14 Loại bỏ dịch nổi, rửa phần kết tủa lần với ethanol 70% 15 Làm khơ DNA kết tủa, hịa tan DNA với thể tích TE 1X nước (khoảng50 µl) 16 Kiểm tra có mặt độ tinh DNA cách điện di gel agarose đo OD Kết li trích thể qua Hình 4.8 10 11 Hình 4.8 DNA tổng số 11 nguồn nấm C cassiicola (Bảng 4.1), li trích theo qui trình cải tiến Hình 4.8 cho thấy mẫu DNA li trích so với kết Hình 4.4 Các phần tạp bị loại bỏ Qui trình ly trích sử dụng RNase giúp loại bỏ RNA Natri acetate kết hợp với isopropanol kết tủa rửa DNA, bảo vệ DNA, thao tác tốt hơn, nhờ mẫu DNA gãy Các mẫu DNA có nồng độ cao (100 ng) đồng cần pha loãng (10 lần) trước tiến hành phản ứng PCR 51 10 11 Hình 4.9 Các mẫu DNA 11 nguồn nấm (Bảng 4.1), sau tiến hành pha lỗng Một số lưu ý q trình li trích : Q trình li trích DNA phụ thuộc nhiều vào thao tác kinh nghiệm người li trích Trong q trình li trích thao tác nhẹ nhàng tránh làm đứt gãy DNA, cần ý số vấn đề sau: Lysis buffer bảo quản 4oC đem sử dụng có tượng kết tủa ảnh hưởng đến hiệu li trích DNA cần mang ủ 37 C trước sử dụng Quá trình nghiền nấm Nitơ lỏng cần thao tác tay, không mạnh gây ảnh hưởng đến đứt gãy DNA Ở lần ly tâm thứ sau ly tâm phần dịch phía chưa ly tâm lại Khi chuyển dịch sang eppendorf (sau ly tâm lần thứ nhất) cần cẩn thận tránh lấy phải phần tạp phía Thường bước chỉnh pipet 400ul hút khoảng 300 μl vừa Tóm lại qui trình li trích DNA ổn định hiệu quả, phù hợp để li trích DNA nấm C cassiicola 4.3 Thiết lập qui trình RAPD đánh giá độ đa dạng di truyền chủng nấm C cassiicola phân lập đƣợc từ vƣờn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống –trại thực ngiệm Lai Khê– VNCCSVN (Bình Dƣơng) 4.3.1 Thí nghiệm 1: khảo sát qui trình RAPD Silva cộng sự, 2003 Thực theo qui trình sản phẩm PCR khơng có băng sau điện di gel dù Silva ctc, 2003 thu dược kết tốt phân tích đa dạng di 52 truyền 42 chủng nấm C cassiicola với primer OPL-08, OPM-O5, OPD 18, băng DNA tạo có kích từ 300bp đến 2600bp Điều hóa chất có nguồn gốc khác thiết bị PCR khác (máy thermo cycler khác nhau) Chúng thử nghiệm vài qui trình khác nhiên kết không tốt lên Trên cớ sở lý thuyết (mục 2.6.2), tham khảo số qui trình nhiệt tác giả khác (P romruensukharom cộng sự, 2005; Silva cộng sự, 1998, 2002, 2003) trải qua trình phân tích, thử nghiệm, cuối chúng tơi đề qui trình nhiệt sau Bảng 4.3 Chƣơng trình nhiệt đƣợc xây dựng thí nghiệm Số lần lập lại 39 Các bước Nhiệt độ (0C) 94 94 35 74 72 Thời gian phút 45 giây phút phút 10 phút giữ 40C Với qui trình nhiệt Bảng 4.3 sản phẩm PCR xuất băng điện di gel Tuy nhiên băng mờ Do chúng tơi nghĩ số chu kỳ thành phần hóa chất chưa tối ưu 5 6 Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm PCR thí nghiệm 1, primer OPM-O5, nguồn nấm 4, 5, 6, (Bảng 4.1) 53 4.3.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hƣởng yếu tố chu kỳ đến phản ứng RAPD Hình 4.10 cho thấy phẩm PCR có xuất băng gel điện di kết băng mờ Mặt khác kỹ thuật RAPD thường tiến hành với 45 chu kỳ, 45 chu kỳ cho số lượng sản phẩm nhiều so với 40 chu kỳ (Kurt Weising, Hide Nybom, Kirten Wolff, Wieland Meyer, 1995) Do chúng tơi tăng số chu kỳ lên 42 45 chu kỳ Kết thể qua hình 4.11 Chúng tơi tiến hành thí nghiệm máy PCR: Master gradient PCR, Bio rad, PTC100 Thermal cycler Do loại máy PCR khác có thời gian chuyển bước 2, 3, (Bảng 4.3) chu kì nhiệt khác Nên chương trình nhiệt có hai loại máy PCR có xuất băng diện di gel: Master gradient PCR Bio rad sản phẩm PCR có băng điện di gel 40 chu kỳ 42 chu kỳ B M B M 45 chu kỳ B M Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm PCR thí nghiệm thực với primer OPM - O5, nguồn nấm (Bảng 4.1), máy PCR Master gradient PCR (M), Bio rad (B Qua Hình 4.11 cho thấy 45 chu kỳ băng DNA rõ hơn, sản phẩm PCR nhiều Cả hai máy PCR Master gradient PCR Bio rad cho sản phẩm PCR có băng điện di, nhiên máy PCR Master gradient PCR với chất lượng băng tốt Do để đảm bảo tính xác cho nghiên cứu chúng tơi định chọn máy PCR: Master gradient PCR để thực nghiên cứu 54 4.3.3 Thí nghiệm Khảo sát ảnh hƣởng yếu tố MgCl2, dNTP, primer, DNA, Taq - polymerase (Promega) lên phản ứng RAPD Phản ứng PCR hệ tương thích thành phần hóa chất xác định cụ thể thực nghiệm Với mục tiêu tối ưu hóa cho phản ứng RAPD chúng tơi tiến hành thí nghiệm 3: thay đổi thành phần hóa chất phản ứng RAPD Kết thể Hình 4.12 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 (a) NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 (c) (b) NT7 NT8 NT9 NT10 (d) Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm RAPD nghiêm thức từ – với primer OPL-08 (Hình 4.12.a), primer OPM-O5 (Hình 4.12.b), primer OPD - 18 (Hình 4.12.c), nghiệm thức 7-10 nguồn nấm (Bảng 4.1) với primer OPM-O5 (Hình 4.12.d), nguồn nấm (Bảng 4.1), NT:(nghiệm thức) Qua Hình 4.12 cho thấy primer nghiệm thức tối ưu Do dó chúng tơi chọn nghiệm thức để tiến hành nghiên cứu  Sau hai lần lập lại thí nghiệm 1, 2, chúng tơi chọn qui trình RAPD cho kết tốt Quy trình thể qua Bảng 4.4 Bảng 4.5 55 Bảng 4.4 Thành phần hóa chất phản ứng RAPD thu đƣợc sau thí nghiệm 1, 2, Hóa chất Dung dịch gốc Nồng độ cuối Thể tích sử dụng PCR buffer 10X 1X μl MgCl2 25 mM 2,5 mM μl dNTP 10 mM 0,3 mM 0,3 μl primer 10 pmol/μl 0,5 mM μl Taq DNA polymerase 5U 0,5 U 0,1 μl DNA mẫu 10 ng/μl 10 ng μl 5,6 μl H2 O Bảng 4.5 Chƣơng trình nhiệt đƣợc xây dựng sau thí nghiệm 1, 2, Số lần lập lại 45 Các bước Nhiệt độ (0C) 94 94 35 74 72 Thời gian phút 45 giây phút phút 10 phút giữ 40C 4.3.4 Đánh giá độ đa dạng di truyền chủng nấm C cassiicola phân lập đƣợc từ vƣờn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống trại thực nghiệm Lai Khê – VNCCSVN (Bình Dƣơng) Để phát đa hình nguồn nấm trên, primer (OPL-08, OPMO5, OPD - 18) sử dụng phản ứng PCR DNA thu từ chủng Corynespora cassiicola (Burt &Curt) Wei, theo qui trình tối ưu sau nghiệm thức Sản phẩm RAPD primer quan sát theo kết điện di gel (Hình 4.13) Mỗi giếng đại diện cho dịng, băng diện với kích thước phân tử xác định kết tăng bội sợi đơn DNA gốc Các đoạn DNA có trọng lượng phân tử di chuyển với khoảng cách gel Sự đa dạng di truyền phân tử khác biệt băng DNA hình thành 57 M 10 11 10 11 Hình 4.13.a (a) M Băng mờ Băng 400 bp (.b) M 10 11 Băng 1450 bp Băng 650 bp Băng 800bp (c) Hình 4.13 Kết điện di sản phẩm RAPD 11 nguồn nấm C cassiicola (Bảng 4.1) với primer OPL-08 (Hình 4.13.a), primer OPM-O5 (Hình 4.13.b), primer OPD - 18 (Hình 4.13.c) Nồng độ gel 2%, hiệu điện 40V, thời gian 70 phút, M: DNA ladder (1.5 Kb) 58 Hình 4.14 Phát băng chức detected band Ngồi cịn có số băng tách khơng rõ q trình điện di băng có kích thước gần nên băng tách khơng rõ, bên cạnh cịn có tượng băng di chuyển khơng đều, điện cực bị cong hay hiệu ứng thành máy điện di ảnh hưởng đến di chuyển DNA Những trường hợp nên thực lại phản ứng PCR hay chạy điện di lại, cho lượng mẫu nhiều chỉnh sửa máy điện di cho kết tốt Những nguyên nhân khiến cho việc thu thập liệu để phân nhóm cần tiến hành cẩn thận Ở primer nguồn nấm số cho số lượng băng Điều đặc điểm di truyền dịng nấm làm giảm vị trí bắt cặp primer này, làm giảm số lượng băng Ba nguồn nấm 8, 9, 10 cho kiểu băng khác biệt, nên phân biệt nguồn nấm 7, 8, 9, 10 với nguồn nấm khác (trong phạm vi nghiên cứu này) Qua Hình 4.13.a cho thấy với primer OPL-08 sản phẩm tạo có 14 băng, kích thước từ 300 bp – kp, 14 băng đa hình Trung bình có 5.5 băng/nguồn nấm Nguồn nấm số có có băng (khoảng 380 bp 450 bp) dó phân biệt nguồn nấm với nguồn nấm lại (trong phạm vi nghiên cứu này) 59 Qua Hình 4.13.b cho thấy với primer OPM-O5 sản phẩm tạo có 15 băng, kích thước từ 200 bp – 2600 bp Trung bình có 5.2 băng/nguồn nấm Có băng đồng hình 400 bp, 14 băng cịn lại đa hình Băng 400 bp xuất ổn định, tiếp tục nghiên cứu để tìm mối quan hệ với tính trạng có liên quan Qua Hình 4.13.c cho thấy với primer OPD - 18 sản phẩm khuếch đại tạo có băng, kích thước từ 450 bp – 1850 bp Cả băng đa hình, primer cho số lượng băng đa hình thấp Trung bình có băng/nguồn nấm Với Primer OPD - 18 sản phẩm khuếch đại tạo nguồn nấm số cho băng (800 bp), nguồn nấm số cho băng (800 bp, 650 bp) Nguồn nấm số cho băng, có băng 1450 bp có nguồn nấm Do tiếp tục nghiên cứu để dụng primer thị (marker) phân tử cho nguồn nấm số 1, 7, Từ kết dẫn đến số nhân xét sau: Phản ứng RAPD nhạy cảm với thành phần hóa chất, cần thay đổi yếu tố sản phẩm thu khác Do cần kiểm tra lại tồn quy trình có thay đổi yếu tố Chỉ sử dụng loại dụng cụ thiết bị thực kỹ thuật RAPD Đặc biệt nên sử dụng loại eppendorf thành mỏng giúp trao đổi nhiệt tốt hơn, không dán nhãn vào thành eppendorf chạy PCR Kỹ thuật đổ gel: agarose chưa tan agarose nguội đổ Điện trường máy điện di: điện không ổn định điện cực bị cong.v.v Dung dịch điện di: cần thay dung dịch điện di khác 4.3.5 Phân tích kết phản ứng RAPD phần mềm NTSYS Kết phát băng mã hoá dạng nhị phân, theo ngun tắc có băng ghi khơng có băng ghi (Phụ lục 2) Số liệu thu đem xử lý 60 phần mềm NTSYSpc 2.1 Kết hiển thị theo dạng số liệu dạng di truyền Hình 4.15 Kết đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS nguồn nấm C cassiicola Qua Hình 4.15 cho thấy hệ số đồng dạng di truyền 11 nguồn nấm biến thiên từ 0,3142 – 0,9428 Như mẫu phân tích có quan hệ di truyền xa Tuy nhiên kết luận phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp Nếu mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp chiếm tỷ lệ lớn mẫu phân tích có quan hệ di truyền xa Ngược lại vài mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp khơng kết luận Tuy nhiên kết khó dùng đánh giá đa dạng di truyền Trên sở bảng hệ số đồng dạng di truyền, xây dựng phả hệ (dendrogram) 61 N.1.1 H ì n N.1 h N.1.2 N.2 C â Hình 4.16 Cây phả hệ (dendrogram) 11 nguồn nấm C cassiicola Qua Hình 4.16 cho thấy hệ số đồng đạng di truyền nguồn nấm sử dụng nghiên cứu biến thiên từ 0,43 – 0,94 Cây phả hệ (dendrogram) có nhiều nhánh Điều cho thấy có đa dạng di truyền nguồn nấm nghiên cứu Kết phù hợp với đánh giá: nấm hình thành nhiều nịi sinh lí mới, tăng nguy gây hại cho dvt cao su Phan Thành Dũng, 2006 Cây phả hệ (dendrogram) chia thành nhóm sau: Nhóm (N1) gồm có nguồn nấm :1, 2, 4, 5, 6, 3, 11 Có hệ số đồng dạng di truyền nằm khảng 0,74 – 0,94 Nhóm lại chia thành hai nhóm phụ với hệ số di truyền gần sau: Nhóm N1.1gồm hai nguồn nấm: 11 có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,79 chứng tỏ hai nguồn nấm có quan hệ di truyền gần Nhóm N1.2 gồm năm nguồn nấm: 2, 4, 5, 6, 3, Nhóm có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,79 – 0,94 phả hệ (dendrogram) có nhiều nhánh Điều 62 cho thấy nguồn nấm có nguồn gốc nấm hình thành nịi thích nghi với tính kháng kí chủ Mặt khác nguồn nấm nhóm N1.2 có hệ số đồng dạng di truyền cao nên tính kháng tính mẫn cảm với thuốc bảo vệ thực vật nguồn nấm tương đương Từ ta đề hướng diệt nấm giống Trong nhóm có hai nguồn nấm: có hệ số đồng dạng di truyền cao: 0,94 lại cho màu sắc khác môi trường PDA sau ngày nuôi cấy Nguồn nấm số cho màu đen nguồn nấm số cho màu trắng (Hình 4.6) Điều nói lên tính trạng màu sắc qui định gen hay số gen, mà gen không diện băng tạo kỹ thuật RAPD tiến hành với primer (OPL-08, OPM-O5, OPD - 18) nghiên cứu Nhóm gồm ba nguồn nấm, có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,69 – 0,85 Trong nguồn nấm số có hệ số đồng dạng di truyền thấp nhất: 0,69 nghĩa có khác biệt di truyền so với hai nguồn nấm cịn lại nhóm Tóm lại, phân tích RAPD giúp xác định tương quan di truyền nguồn nấm, từ góp phần làm sở sở cho chiến lược phòng trừ bệnh nghiên cứu đạt hiệu 63 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập 11 nguồn nấm C cassiicola từ mẫu bệnh rụng Corynespora thu thập từ vườn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống trại thực nghiệm Lai Khê– VNCCSVN (Bình Dương) (Bảng 4.2) Xây dựng qui trình ly trích DNA ổn định hiệu quả, phù hợp để li trích DNA nấm C cassiicola (Hình 4.8) Quy trình RAPD tốt quy trình Bảng 4.4 4.5 Qui trình RAPD áp dụng để phân tích đa đạng di truyền quần thể nấm C cassiicola Cả primer dùng kỹ thuật RAPD nghiên cứu cho kết khuếch đại tốt Đã có 35 băng tạo có 34 băng đa hình băng đồng hình Băng 400bp băng đặc trưng thực kỹ thuật RAPD sử dụng primer OPM-O5 11 nguồn nấm sử dụng nghiên cứu Sự khác biệt hình thái dường khơng liên quan đến nhóm RAPD nghiên cứu Việc phân tích RAPD sử dụng primer (OPL-08, OPM-O5, OPD - 18) 11 nguồn nấm sử dụng nghiên cứu lập phả hệ (dendrogram) có hệ số đồng dạng di truyền dao động khoảng 0,43 – 0,94 (Hình 4.15) Cây phả hệ (dendrogram) có nhiều nhánh cho thấy da dạng 11 nguồn nấm sử dụng nghiên cứu Primer OPD – 18 nhận biết nguồn nấm số 1, nguồn nấm sử dụng phạm vi nghiên cứu 5.2 Đề nghị Tăng số lượng mẫu phạm vi lấy mẫu để kết nghiên cứu khái quát 64 Nên tiến hành lấy mẫu kí chủ khác ngồi cao su để xác định nguồn gốc nấm C cassiicola cao su phục vụ cho công tác bảo vệ thực vật Băng 400bp băng đặc trưng thực với primer OPM-O5 tiếp tục nghiên cứu để tìm mối quan hệ với tính trạng có liên quan Có thể áp dụng kỹ thuật có độ tin cậy cao để nghiên cứu đa dạng di truyền nấm C cassiicola như: SSR, AFLP Nghiên cứu nhân tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh như: điều kiện khí hậu, mơi trường, tính độc nguồn bệnh, tính nhạy cảm kí chủ, quần thể nguồn bệnh, tìm mối quan hệ với nhóm RAPD Từ phục vụ cho chiến lược quản lý phòng trừ bệnh, nghiên cứu Nghiên cứu đặc tính sinh học, đa dạng di truyền gen kháng cao su Những nghiên cứu cần có chiến lược hợp tác chặt chẽ tổ chức, viện, quan.v.v 5.3 Hạn chế đề tài Phạm vi lấy mẫu hẹp, số lượng mẫu tách dơn bào tử Chưa có thơng tin tính độc nguồn nấm phân lập, tính mẫn cảm dvt lấy mẫu bệnh Do chưa tìm mối quan hệ nhóm RAPD với tính độc nguồn nấm, tính mẫn cảm dvt cao su 65 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Quỳnh Anh, 2005 Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Anacardium occidental L.) tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu kỹ thuật RAPD AFLP.Khóa Luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm Tp HCM Phạm Văn Bình, 2005 Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Acanardium occidentale L.) trồng tỉnh Ninh Thuận kỹ thuật RAPD AFLP Khóa Luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm Tp HCM Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử Quyển II, Những nguyên tắc chọn giống trồng NXB Nông nghiệp 45-60 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004 Di truyền phân tử NXB Nơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh Trần Văn Cảnh, 2006 Công tác bảo vệ ngành cao su việt nam Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005 Phân tích đa dạng di truyền số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh cao su (Hevea brasliensis Muell Arg) phương pháp RFLP – PCR Khóa Luận tốt nghiệp kỹ sư cơng nghệ sinh học, Đại học Nông lâm Tp HCM Phan Thành Dũng, 2004 Kỹ thuật bảo vệ thực vật cao su Nhà xuất Nông Nghiệp.124 trang Phan Thành Dũng, 2006 Công tác bảo vệ ngành cao su việt nam Hiên trang thác thức mới(.VNCCSVN) Diễn đàn khuyến nông công nghệ.Chuyên đề nâng cao lực cao su tiểu điền 2006(nhiều tác giả).Trang – 21 10 Hồ Huỳnh Thùy Dương 2000 Sinh học phân tử Nhà xuất Đại Học Quốc Gia 11 Nguyễn Hữu Hỗ, 2005 Chuyên đề chuyển gen.Tài liệu giảng dạy Đại Học Nông Lâm 12 Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu Công nghệ sinh học Nhà xuất Nông nghiệp Tp HCM 220 trang 13 Nguyễn Thái Thủy, 2003 PCR Real - time PCR Công ty Bio – Rad 101 trang 14 Nguyễn Hữu Trí, 2004.Cơng nghệ cao su thiên nhiên trang17 – 20 66 15 Bùi Trang Việt, 2001 Sinh học Phân tử Khoa sinh học, ĐH Quốc gia Tp Hồ Chí Minh., trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp Hồ Chí Minh TIẾNG ANH 16 Dũng, P.T., 1995 Studies on C cassiicola (Berk & Curt.) Wei on rubber Masters’ thesis University Pertanian Malaysia 17 Dũng, P.T and Hoan, N.T., 2000 Current status of Corynespora leaf fall in Vietnam Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, – 15, June, 2000 18 Ellis, M.B and Holiday, 1971.Corynespora cassiicola C.M.I Description of Pathogenic Fungi and Bacteria No 303 1-2 19 Kuruvilla Jacob C cộng sự, 2002 A laboratory Manual for International Training on strategies for management of Corynespora Leaf Fall Disease of Heveabrasiliensis 20 Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten Wolff, Wieland Meyer, 1995 DNA fingerprinting in plants and fungi CRC Press 322p 21 Jayashinge, C.K and W.P.K, Silva.1996 Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996 22 Ismail, H., N.Z Radzia and K Silvadadyan, 1996 Management stragies of Corynespora leaf fall with fungicides and cultural practices Presented at workshop onCorynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996 23 Liyanage, A.de., Jayasighe, C cassiicola k and liyanage, N.I.S (1988).Biology, epidemiology and pathogenicity of Corynespora cassiicola leaf fall disease workshop held at Bogor Research Instute, Indonesia, 12th to 13 th february, 1988 24 Sabu, P.I., 2000 Current status of Corynespora leaf fall in India Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, – 15, June, 2000 25 Safiah A and Noor H.H., 2003 Differentiating races of C cassiicola using RAPD and ITS thị (marker)s Journal of Rubber Research 6(1) 59 – 64 67 26 Shukhor S.K and Hidir S.M., 1996 Current status of Corynespora leaf fall disease in Malaysia Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996 27 Silva, W.P.K, Deverall, B.J & Lyon, B.R., 1995 RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of nguồn nấm of the leaf spot fungus C cassiicola Aust J Bot., 43, 609 – 618 28 Silva, W.P.K, Deverall, B.J & Lyon, B.R., 1998 Molecular, physiological and pathological characterization of Corynespora leaf spot fungi from rubber plantations in Sri Lanka Plant pathology, 47 (3), 267-277 29 Silva, W.P.K, Eric H Karunanayake, Ravi L.C Wijesundera andUhanowita M.S Priyanka., 2003 Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation between host and virulence Mycol Res 2003 May;107 (Pt 5):567-71 30 Sinulinga W., Suwanto and Soepena H., 1996 Current status of Corynespora leaf fall in Indonesia Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996 31 Sujanto and Irwan Suhendry., 2000.Corynespora leaf fall disease on Hevea rubber in Indonesia.Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, – 15, June, 2000 32 The International Natural Rubber Organization, 1999 Improvement of management strategy in combating Corynespora leaf fall disease (CLFD) in Hevea brasiliensis TÀI LIỆU TỪ INTERNET 33 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Database: Corynespora cassiicola 34 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids =12884953&dopt=Abstract Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation between host and virulence 35 http://www.irrdb.com/ 68 Annual report 36 http://www.avery.rulger.edu/wssp/studentscholarship/project/achives anion/rapd.html Các từ khóa: rapd+picture+define 37 http://library.uws.edu.au/adt-NUWS/uploads/approved/adtNUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf Các từ khóa: rapd+apply+fungus 38 http:www3.sympatico.ca/roland.pelletier 69 PHỤ LỤC Phụ lục I Thành phần hóa chất phản ứng PCR TAE buffer 50X: + Tris-HCl 242 g/l + Glacial acetic acid 57,1 ml/l + EDTA 0,5M, pH 100 ml/l TE + Tris HCl 10 mM, pH 8,3 + EDTA 1mM Loading buffer + 100 % glycerol + TE 5X buffer + Bromphenol Blue Ethidium bromide +15 l Ethidiumbromide +300 ml TAE 0,5 X Ladder +65 % TAE 0,5X +25 % loading dye 6X +15 % ladder ml 2,5 ml 0,015 ml 70 Phụ lục II Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết RAPD 36 Số thứ tự OP L08 10 11 12 13 14 0p m0 5-4 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0pd 19h8 29 30 31 32 33 34 35 1:L H99/ 0019 11 2:LH9 9/0081 3:L H99/ 0098 4:LH9 9/013 5:LH9 9/0431 6:LH 99/06 17 7:LH 99/06 79 8:LH9 9/005 9:LH 99/02 16 10:L H99/ 067 11:L HH Kích Thước bp 1 1 0 1 1 2200 1850 1750 1500 1400 1300 1200 900 800 600 500 450 350 300 1 1 0 1 0 0 2600 2300 1600 1400 1300 1200 950 800 650 550 480 400 250 200 1 1 1850 1450 1300 1100 800 650 450 Tổng số 60 băng Số lượng băng trung bình: 5,5 băng/nguồn nấm 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 Tổng số 59 băng Số lượng băng trung bình: 5,2 băng/nguồn nấm 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 Tổng số 33 băng Số lượng băng trung bình: băng/nguồn nấm 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 71 Phụ lục III :Danh sách dvt cao su phân lập đƣợc mẫu Số thứ tự 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Dvt cao su phân lập mẫu bệnh LH99/0019 LH99/0081 LH99/0098 LH99/0131 LH99/0431 LH99/0617 LH99/0679 LH99/0053 LH99/0216 LH99/0672 RRIV4 LH99/0028 LH99/0090 LH99/0083 LH99/0093 LH99/0098 LH99/0023 LH99/0622 LH99/0627 LH99/0638 LH99/0648 LH99/0670 LH99/0696 LH99/0698 LH99/0699 LH99/0775 LH99/0291 LH99/0347 LH99/0675 LH99/0679 Số thứ tự 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 Dvt cao su phân lập mẫu bệnh RRIV MT/C/5 MT/C/4 AC/B/18 AC/B/17 LH 97/164 LH 96/347 RRIC 121 MTIT 14 MTIT 16 RO/CM/10 FX 2840 AC 88 PB 255 PB 260 MTI2 ROT5 LH 97/167 LH 82/008 LH 83/152 VM 515 VE2 LH 82/104 LH 82/183 RRIC 100 RRIC 102 GU 969 IAN 6323 LH 82/156 LH 83/161 LH99/0778 ... 22 23 24 25 26 27 28 0pd 19h8 29 30 31 32 33 34 35 1:L H99/ 0019 11 2:LH9 9/0081 3: L H99/ 0098 4:LH9 9/0 13 5:LH9 9/0 431 6:LH 99/06 17 7:LH 99/06 79 8:LH9 9/005 9:LH 99/02 16 10:L H99/ 067 11:L... 2006 Công tác bảo vệ ngành cao su việt nam Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005 Phân tích đa dạng di truyền số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh cao su (Hevea brasliensis Muell Arg)... OPM-O5 tiếp tục nghiên cứu để tìm mối quan hệ với tính trạng có liên quan Có thể áp dụng kỹ thuật có độ tin cậy cao để nghiên cứu đa dạng di truyền nấm C cassiicola nh? ?: SSR, AFLP Nghiên cứu nhân tố