Luận văn : PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR part 3 potx

10 Nấm có khả năng gây rụng lá non lẫn lá già, cuống lá và chồi. Hơn nữa, nấm gây bệnh quanh năm và suốt chu kỳ sống của cao su nên có tác hại rất lớn, nhất là trên các dvt mẫn cảm. 2.3.4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh Bệnh xuất hiện trên lá, cuống lá và chồi với các triệu chứng biểu hiện rất khác nhau. - Trên lá: Vết bệnh màu đen với hình dạng xương cá dọc theo gân lá, vết bệnh lan rộng nếu điều kiện thuận lợi, gây chết từng phần, sau đó lá đổi màu vàng cam và rụng từng lá một. Trên lá non vết bệnh hình tròn màu xám đến nâu với vòng màu vàng xung quanh, có khi hình thành lỗ. Lá quăn và biến dạng, sau đó rụng toàn bộ. - Trên chồi và cuống lá: Các chồi xanh dễ nhiễm bệnh, đôi khi nấm bệnh cũng gây hại chồi đã hóa nâu. Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ ra sau đó hóa đen, vết bệnh có thể phát triển dài đến 20 cm gây chết chồi, đôi khi chết cả cây. Nếu dùng dao cắt bở lớp vỏ ngoài sẽ xuất hiện những sọc đen ăn sâu trên gỗ, chạy dọc theo vết bệnh. Trên cuống lá với vết nứt màu đen có chiều dài 0,5 – 3,0 mm. Nếu cuống lá bị hại, toàn bộ lá chét bị rụng khi còn xanh mặc dù không có một triệu chứng nào xuất hiện trên phiến lá (Chee, 1988). 2.4. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) Kỹ thuật PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1990 được sử dụng rộng rãi nhất trong số các ứng dụng của sinh học phân tử. Về thực chất đây là phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của các tế bào (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000) 2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán phát 11 hiện mầm bệnh trên người, động vật, thực vật, thực phẩm…(Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000) Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000) Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000). Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như hình 2.2. Bƣớc 1 (tách sợi đôi DNA, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, ở điều kiện này phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn, thường là ở nhiệt độ 94 - 95 C trong vòng 30 giây đến 1 phút. 12 Hình 2.2: Mô tả phản ứng PCR Bƣớc 2 (bắt cặp, annealation): trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây. Bƣớc 3 (kéo dài, elongation - extension): dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới được tạo thành từ mạch được kéo dài. Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước như trên được lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lượng DNA được gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 10 6 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm được nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc 13 gel polyacrylamide, sau đó tiến hành quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm) (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000). 2.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả của phản ứng PCR 2.4.2.1. DNA khuôn DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch, nhưng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại từ dịch DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thường phương pháp này được áp dụng trong chẩn đoán. Lượng DNA được dùng trong phản ứng PCR là một lượng cực nhỏ, khoảng 1 g, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm lượng DNA khuôn xuống còn 100 ng. Nếu lượng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không như mong muốn hay còn gọi là dương tính giả hay sản phẩm tạp nhiễm. Khuôn DNA có thể được thu nhận từ các mẫu không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần 2.4.2.2. Enzyme Thông thường, DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao. Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại enzyme chịu nhiệt khác nhau đã được phát hiện và đưa ra thị trường với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn. Như enzyme Tth polymerase từ Thermus thermophilus, enzyme này hoạt động như một enzyme phiên mã ngược thông qua sự hình thành cDNA trong điều kiện RNA làm khuôn và ion Mn ++ , nhưng trong điều kiện DNA khuôn và ion Mg ++ , Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. 2.4.2.3. Primer và nhiệt độ lai Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau: - Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược, không có cấu trúc dimer primer do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer. 14 - Nhiệt độ nóng chảy của primer xuôi và primer ngược không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng, tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần. - Các primer phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen. - Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và primer ngược không được quá lớn, phản ứng PCR tối ưu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb. 2.4.2.4. Các thành phần khác trong phản ứng PCR - Bốn loại nucleotide thường được sử dụng với nồng độ 200 M/ mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dương tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. - Nồng độ Mg++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ tối ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường nồng độ tối ưu này phải được xác định riêng cho từng phản ứng. 2.4.2.5. Số lượng chu kỳ phản ứng Số lượng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thường không vượt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm vì những nguyên nhân như sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với primer mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ còn tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu. 15 2.4.2.6. Thiết bị và dụng cụ dùng trong phản ứng PCR Thiết bị cho phản ứng PCR như máy luân nhiệt (thermocycler) cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc thoát hơi nước trong quá trình phản ứng. Eppendorf sử dụng trong phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt. 2.5. Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease - RE) 2.5.1. Giới thiệu Trong phân tích genome, enzyme làm nhiệm vụ rất quan trọng là nhóm enzyme với thuật ngữ chung là enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease – RE), ghi nhận các trình tự đặc biệt của nucleotide, và cắt DNA tại vị trí rất đặc biệt (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999). Các RE được nghiên cứu lần đầu tiên vào những năm 1950. Các RE bao gồm một phần của tính chất cải biến (modification) viết tắt là M. Hệ thống R-M trong vi khuẩn giúp nó bảo vệ chống lại sự xâm nhập của thực khuẩn thể và những nhân tố lạ về di truyền. Từ kiểu hình được phân lập đầu tiên, hệ thống R- M bây giờ có thể sẵn sàng cho những phân tích di truyền rất có hiệu quả. Hệ thống R-M của vi khuẩn phá hủy những phân tử DNA lạ xâm nhập vào tế bào bằng con đường lây nhiễm, tiếp hợp, chuyển nạp. Hệ thống R-M của vi khuẩn có xu hướng tạo ra một thế cân bằng ở sinh vật nhân giả (prokaryotic) như là một hệ thống miễn dịch. Hệ thống R-M được tìm thấy trong vi sinh vật, chủ yếu là ở vi khuẩn. Nó rất đa dạng ngay cả trong cùng một tế bào. Số RE được tư liệu hóa cho đến nay trên 1200, trong đó có 17 thuốc type I, 179 type II, 4 type III rất chuyên tính, bên cạnh đó hơn 190 nhóm DNA modification methyltranferase đã và đang được định tính. Type I: Khi một enzyme nhận biết được một trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến một vị trí cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng độ vài chục nucleotide. Type II: enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí nhận biết đó. Type III: enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. 16 Type I và Type III có vai trò rất hạn chế, tuy nhiên type II là những enzyme cắt có vai trò rất quan trọng trong trong kỹ thuật biến đổi di truyền. Hệ thống R-M thường có hai hoạt động chính: (a) một RE viết tắt là R- Enase rất chuyên tính tại một vị trí nào đó, nó có nhiệm vụ tiêu hóa DNA ngoại sinh, (b) một methyltranferase là M-Mtase có nhiệm vụ cải tiến và bảo vệ DNA nội sinh không bị tiêu hóa bởi R-Enase. 2.5.2. Định danh các enzyme Smith và Nathan (1973) đã đề nghị một hệ thống định danh thống nhất như sau: - Tên loài của sinh vật là ký chủ được xác định xong lấy chữ cái đầu tiên của genus cộng thêm 2 chữ cái của tên loài bằng 3 chữ, viết theo kiểu in nghiêng, thí dụ: Escheria coli = Eco và Haemophilus influenzae = Hin. Bảng 2.1. Một vài RE và vị trí phân cắt của nó Nguồn vi khuẩn Ký hiệu enzyme Trình tự 5’ – 3’ 3’ – 5’ Haemophilus aegyptius Staphylococcus aureus 3A Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus influenzae Rd Providencia stuartii Seratia marcesens Xanthomonas malvacearum HaeIII Sau3AI BamHI EcoRI HindIII PstI SmaI XmaI GG/CC CC/GG GATC CTAG G/GATCC CCTAG/G G/AATTC CTTAA/G A/AGCTT TTCGA/A CTGCA/G G/ACGTC CCC/GGG GGG/CCC C/CCGGG GGGCC/C Ghi chú: Dấu “/” chỉ vị trí cắt. - Nòi của vi khuẩn được viết bằng chữ in hoa xụt xuống hàng dưới. Thí dụ, Ecok. Trong trường hợp hệ thống R-M được chuyên tính bởi virus hay plasmid 17 người ta dùng chữ viết tắt của tên là ký chủ và nguyên tố ngoại nhiễm được xác định theo sau chữ ấy, viết xuống hàng dưới ví dụ, EcoPI, EcoRI. - Khi một dòng ký chủ nào đó có nhiều hệ thống R-M khác nhau, người ta dùng số la mã đánh dấu ở phía sau. Thí dụ, HindI, HindII, HindIII… Số la mã này không phải là biểu thị loại hình enzyme. - Tất cả mọi RE đều có tên chung là “endonuclease R”, nhưng bên cạnh đó, nó còn mang thêm tên hệ thống, như R.HindIII. Tương tự, modification enzyme có tên chung là methylase M, theo sau đó là tên hệ thống. Modification enzyme của H. influenzae Rd tương hợp với endonuclease R.Hin d III sẽ được ghi là M.Hin d III. Trong thực tế người ta muốn việc sử dụng khi viết sao cho đơn giản, chữ nhảy xuống dưới không cần thiết, toàn bộ chữ viết tắt được ghi cùng một hàng, thí dụ, HindIII, và khi biết rõ là chỉ có RE, ký hiệu tượng trưng cho endonuclease R bị xóa bỏ (Bùi Chí Bửu Và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.5.3. Trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn Các RE có tính chuyên biệt với một trình tự nào đó và nó sẽ cắt nucleotide đúng vị trí xác định mà nó tìm thấy, vị trí này được gọi là trình tự mục tiêu, với số nucleotide trong chuỗi được xác định, thường là 4 – 8 nucleotide. Từ đó, DNA hệ gen sẽ được cắt ra thành những đoạn ngắn, hoặc dài có kích thước khác nhau. Tuy nhiên đối với một số enzyme, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotide của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotide khác (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000). Một đặc điểm của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, có nghĩa là hai mạch của trình tự là hoàn toàn giống nhau nếu chúng được đọc theo chiều 5’ –3’. Như vậy vị trí cắt là giống nhau trên 2 mạch (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000; Desmond và Nicholl, 1994) 2.5.4. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA Việc sử dụng các enzyme cũng khá đơn giản, chỉ cần thêm một lượng enzyme thích hợp vào DNA mục tiêu trong dung dịch đệm thích hợp và sau đó để cho phản ứng xảy ra ở 37 C. Hoạt tính của các enzyme được biểu hiện bằng đơn vị (unit), là lượng enzyme cần thiết để phân cắt 1 g DNA thời gian giờ ở 37 C. Phần lớn các thí nghiệm đòi hỏi phải phân cắt hoàn toàn DNA mục tiêu, tuy nhiên trong một số 18 trường hợp sử dụng kết hợp nhiều enzyme chỉ cần tính toán nồng độ và thời gian ủ để đạt được sự phân cắt không hoàn toàn (Desmond và Nicholl, 1994). Các kiểu đoạn DNA tạo thành do sự phân cắt của các enzyme phụ thuộc vào trình tự nhận biết và vị trí điểm cắt trong trình tự này. Chiều dài của đoạn DNA tùy thuộc vào tần số xuất hiện của trình tự nhận biết. Vị trí cắt của enzyme sẽ xác định kiểu đầu của đoạn DNA tạo thành (đầu bằng – blunt end hay đầu dính – sticky end). Nếu RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm sẽ tạo thành các đoạn DNA có đầu bằng, sau khi cắt, 2 đầu bằng không thể tự kết hợp trở lại, để nối chúng lại cần phải dùng enzyme T4 ligase. Nếu vị trí cắt của RE lệch nhau trên hai mạch thì sẽ tạo thành các đầu dính, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Việc tạo thành đầu bằng hay đầu dính có ý nghĩa rất quan trọng đối với những thao tác ở mức độ DNA, đặc biệt đặc tính cắt tạo đầu dính được ứng dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in vitro, hai phân tử có nguồn gốc khác nhau được cắt bằng cùng một loại RE sẽ có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính (Desmond và Nicholl, 1994; Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000). Bảng 2.2. Các RE xếp thứ tự theo bản chất vị trí cắt của nó Đầu 5’ Đầu 3’ Đầu bằng Enzyme Trình tự Enzyme Trình tự Enzyme Trình tự TaqI ClaI MboI BglII BamHI BclI HindIII NcoI XmaI XhoI EcoRI SalI XbaI T/CGA AT/CGAT /GATC A/GATCT G/GATCC T/GATCA A/AGCTT C/CATG C/CCGG C/TCGAG G/AATTC G/TCGAC T/CTAGA PstI SacI SphI BdeI ApaI KpnI CTGCA/G GAGCT/C GCATG/C GGCGC/C GGGCC/C GGTAC/C AluI FnudII DpnI HaeIII PvuII SmaI NaeI HpaI NruI BalI MstI AhaIII EcoRV AG/CT CG/CG GA/TC GG/CC CAG/CT CCC/GGG GCC/GGC GTT/AAC TCG/CGA TGG/CCA TCG/GCA TTT/AAA GAT/ATC 19 Trong quá trình thực hiện phản ứng thủy giải của enzyme cũng cần lưu ý là mỗi RE hoạt động tối ưu trong những điều kiện phản ứng nhất định, nhất là về mặt dung dịch đệm, tốt nhất là nên tuân thủ những khuyến cáo của nhà sản xuất RE sẽ giữ được hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn được bảo quản ở -20 C . Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra sau khi đã chuẩn bị đủ tất cả các thành phần khác và giữ trong đá trong khoảng thời gian càng ngắn càng tốt trước khi cất trở lại vào -20 C. Phản ứng cắt được tiến hành trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xúc của enzyme với cơ chất. Tuy nhiên cũng cần đảm bảo là thể tích của RE không vượt quá 1/10 t hể tích của phản ứng vì glycerol sẽ ức chế hoạt động của enzyme (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000) 2.5.5. Phân tích kết quả của các phản ứng cắt bằng RE Phản ứng cắt giới hạn sẽ tạo thành nhiều đoạn DNA, kích thước của chúng khác nhau tùy thuộc vào vị trí nhận biết của enzyme có trong phân tử phân tích. Do vậy cần có phương pháp xác định kích thước và số đoạn của các đoạn tạo thành. Dù phân tử có được phân cắt hay không, chúng ta cũng có thể kiểm tra thông qua độ nhớt của dung dịch. Phân tử DNA lớn hơn tạo nên dung dịch có độ nhớt cao hơn những phân tử nhỏ hơn, có nghĩa là sự phân cắt làm giảm độ nhớt của dung dịch. Tuy nhiên, những thao tác đối với số lượng và kích thước của sản phẩm tạo thành khó khăn hơn nhiều. Điều này được giải quyết vào đầu những năm 1970 khi kỹ thuật điện di được phát triển (Desmond và Nicholl, 1994). 2.5.5.1. Tách các phân tử bằng điện di trên gel Do phân tử DNA tích điện âm nên khi đặt phân tử DNA trong một điện trường phân tử DNA sẽ di chuyển về phía điện cực dương. Tốc độ di chuyển của phân tử DNA tùy thuộc vào hình dạng và tỉ lệ điện tích/ khối lượng của chúng. Tuy nhiên, hầu hết các phân tử DNA đều có hình dạng giống nhau và tỉ lệ điện tích/khối lượng gần như nhau nên không thể tách các phân tử DNA bằng kỹ thuật điện di chuẩn. Tuy nhiên, phân tử DNA có kích thước khác nhau có thể được phân biệt khi điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide. Gel là một mạng lưới lỗ mà phân tử DNA cần phải vượt qua để đi đến cực dương. Do vậy, phân tử nào có kích thước . điện di được phát triển (Desmond và Nicholl, 199 4). 2.5.5.1. Tách các phân tử bằng điện di trên gel Do phân tử DNA tích điện âm nên khi đặt phân tử DNA trong một điện trường phân tử DNA sẽ di. 2 .3. 4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh Bệnh xuất hiện trên lá, cuống lá và chồi với các triệu chứng biểu hiện rất khác nhau. - Trên l : Vết bệnh màu đen với hình dạng xương cá dọc. Nấm có khả năng gây rụng lá non lẫn lá già, cuống lá và chồi. Hơn nữa, nấm gây bệnh quanh năm và su t chu kỳ sống của cao su nên có tác hại rất lớn, nhất là trên các dvt mẫn cảm. 2 .3. 4.