Luận văn : PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR part 4 potx

20 nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và ngược lại. Tùy theo thành phần của gel mà các phân tử DNA có kích thước khác nhau có thể được phân tách khi điện di trên gel đó (Desmond và Nicholl, 1994). 2.5.5.2. Quan sát các phân tử DNA trên gel Nhuộm bằng hóa chất Cách đơn giản nhất để xem kết quả điện di là nhuộm gel bằng hóa chất có thể làm cho phân tử DNA thấy được. Hóa chất thường được sử dụng để nhuộm gel là ethidium bromide. Các băng DNA có kích thước khác nhau phân tách trên gel sẽ được quan sát dễ dàng dưới ánh sáng của tia tử ngoại (Desmond và Nicholl, 1994). Ảnh phóng xạ tự ghi của những phân tử DNA đƣợc đánh dấu phóng xạ Một hạn chế của phương pháp nhuộm ethidium bromide là độ nhạy bị hạn chế. Lượng DNA của một băng nếu ít hơn 25 ng sẽ không thể hiển thị khi nhuộm gel với ethidium bromide. Một phương pháp khác là sử dụng các dấu hiệu có hoạt tính phóng xạ để đánh dấu các phân tử DNA. Khi đó, DNA có thể được quan sát khi đặt lên bản gel một tấm phim nhạy cảm với tia X. Phân tử DNA cũng có thể được đánh dấu bằng cách gắn các nucleotide có mang đồng vị Phospho phóng xạ P 32 . Ngoài ra, một số phương pháp khác cũng cho phép đánh dấu các phân tử DNA (Desmond và Nicholl, 1994). 2.5.6. Bản đồ giới hạn Hầu hết các đoạn DNA đều có trình tự nhận biết đối với những enzyme khác nhau. Điều này có lợi vì nó cho biết vị trí tương đối của những vị trí cắt này. Kỹ thuật thu nhận những thông tin như vậy được gọi là lập bản đồ giới hạn (restriction mapping). Việc này liên quan đến việc sử dụng enzyme cắt riêng lẻ và sau đó cắt kết hợp bằng nhiều enzyme, các đoạn được tạo thành được chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra kích thước. Từ những dữ liệu thu được ta có thể lập được bản đồ giới hạn (Desmond và Nicholl, 1994). 2.6. Vùng ITS (internal transcribed spacer) và vai trò của nó trong nghiên cứu đa dạng di truyền Hiện nay, vùng ITS có lẽ là vùng DNA được giải trình tự rộng rãi nhất ở loài nấm. Nó là một công cụ hữu dụng nhất cho hệ thống phân tử ở cấp độ loài (species) và trong cùng loài (within species), ví dụ như xác định các nòi địa lý. Do mức độ biến dị của nó 21 cao hơn các vùng khác của rDNA, sự biến dị giữa các đoạn lặp rDNA riêng biệt có thể được quan sát ở cả trong vùng ITS và vùng IGS (intergenic spacer region) (http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm). Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS ở nấm. Ghi chú: LSU: large subunit SSU: small subunit IGS: intergenic spacer Nguồn: http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm Hình 2.4: Lƣợc đồ các primer trên vùng ITS. Nguồn: http://plantbio.berkeley.edu/~bruns/ 22 Hiện nay, có nhiều primer được thiết kế để khuếch đại vùng ITS và một số primer đã được phát triển nhằm khuếch đại chọn lọc hơn trình tự vùng ITS ở nấm. Bảng 2.3: Một số primer và trình tự của nó dùng trong nghiên cứu vùng ITS của nấm Tên primer Trình tự 5’ – 3’ Tác giả ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al, 1990 ITS 2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC White et al, 1990 ITS 3 GCATCGATGAAGAAAACGCAGC White et al, 1990 ITS 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al, 1990 ITS 5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG White et al, 1990 ITS1-F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA Gardes & Bruns, 1993 ITS4-B CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG Gardes & Bruns, 1993 5,8S CGCTGCGTTCTTATCG Vilgalys lab. 5,8SR TCGATGAAGAACGCAGCG Vilgalys lab. Nguồn: http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm 2.7. Tình hình nghiên cứu về C. cassiicola trong và ngoài nƣớc 2.7.1. Những nghiên cứu về C. cassiicola ngoài nƣớc C. cassiicola đã được nghiên cứu khá nhiều ở nhiều nước trên thế giới, do C. cassiicola có phổ ký chủ rộng (gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau). Ngoài những nghiên cứu về tình hình và khả năng gây hại của C. cassiicola ở các khu vực khác nhau, C. cassiicola trên các ký chủ khác nhau cũng đã được nghiên cứu và so sánh mức độ khác biệt về di truyền và tìm hiểu khả năng nhận biết các dòng C. cassiicola, cũng như mức độ và khả năng gây độc của C. cassiicola. Kết quả của những nghiên cứu này cho thấy, tính độc của C. cassiicola ngày càng phát triển đa dạng và rất biến thiên, khả năng gây độc của C. cassiicola trên các dvt cao su khác nhau, tùy theo giai đoạn sinh trưởng. C. cassiicola có khả năng tổng hợp các enzyme phân giải pectin và enzyme phân giải cellulose ngoài cơ chế biến dưỡng độc tố (C.K. Jayashinge, 2000). 23 Nghiên cứu biến dị di truyền của 42 isolates nấm C. cassiicola trên các ký chủ khác nhau bằng phương pháp RAPD – PCR của Silva và các cộng sự (1995) cho thấy, có 5 nhóm di truyền đã được xác định, điều này có nghĩa là có sự khác biệt di truyền đáng kể giữa các isolates nấm C. cassiicola thu thập từ các ký chủ khác nhau. Những kết quả nghiên cứu này làm cho việc nghiên cứu tạo các dvt cao su kháng bệnh trở nên dễ dàng hơn (Silva và cộng sự, 2003). Những khác biệt về di truyền của nấm bệnh C. cassiicola trên ký chủ khác nhau đã được nghiên cứu bằng phân tích đa hình RFLP trên vùng ITS (internal transcribed spacer) của ribosome DNA và đa hình các đoạn DNA được khuếch đại từ DNA tổng số. Các chủng C. cassiicola có thể được phân biệt với các loài lân cận thuộc giống Helminthosporum dựa trên kích thước của vùng ITS được khuếch đại, nhưng không thể phân biệt rõ ràng vì vùng ITS của các isolates có kích thước giống nhau và phân cắt bằng các enzyme cắt giới hạn cũng cho những kết quả giống nhau. Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD đã phát hiện được khác biệt đáng kể giữa một số isolates C. cassiicola. Phân tích theo nhóm các đoạn DNA được khuếch đại cho thấy 5 isolates được xếp vào 3 nhóm di truyền khác nhau tương ứng với nguồn gốc ký chủ và đặc điểm hình thái. Các kỹ thuật này có thể được mở rộng để nghiên cứu biến dị trong cùng isolates C. cassiicola trên cây cao su ở Sri Lanka, nơi mà các chủng C. cassiicola độc tính cao đã xuất hiện đe dọa nghiêm trọng cho ngành công nghiệp cao su thiên nhiên của nước này (Silva và cộng sự, 2002). Safiah Atan và Noor Hisham Hamid (2003) đã sử dụng kỹ thuật RAPD và khuếch đại vùng ITS để phân tích 9 isolates nấm C. cassiicola từ Hevea brasiliensis. Kỹ thuật RAPD với các primer ngắn đã cho phép phân biệt được 2 nhóm isolates, là isolates gây nhiễm cho các dvt RRIM 2020 và nhóm isolates gây nhiễm cho các dvt RRIM 600 và các dvt cao su khác. Kỹ thuật khuếch đại vùng ITS cho thấy 8/9 isolates là đơn hình khi phân tích sản phẩm khuếch đại bằng các enzyme cắt giới hạn. Silva và cộng sự (1998) kết hợp nghiên cứu đặc điểm hình thái, độc tính và đặc điểm phân tử của nấm C. cassiicola thu nhận từ các đồn điền cao su ở Sri Lanka. 32 isolates C. cassiicola được thu nhận từ phổ ký chủ rộng và địa điểm khác nhau đã được phân tích RFLP trên vùng ITS được khuếch đại và kỹ thuật RAPD khuếch đại hệ gen C. cassiicola bằng các primer ngẫu nhiên. Vùng ITS cho kết quả giống nhau 24 ở tất cả các isolates khi phân tích bằng các enzyme cắt giới hạn. Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD đã phát hiện sự đa hình rất lớn giữa các isolates, phân tích các dữ liêu thu thập được từ việc sử dụng 15 oligonuceotide primer đã xác định được có 7 nhóm RAPD khác nhau, các isolates có sự tương quan rất lớn giữa nhóm RAPD và vị trí phân lập cũng như kiểu gen của cây trồng ký chủ mà từ đó các isolates được phân lập. Ngoài ra, cũng có mối tương quan giữa nhóm RAPD với tỷ lệ tăng trưởng của isolate và tính độc trên các cây trồng ký chủ khác nhau. 2.7.2. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong nƣớc Bệnh rụng lá Corynespora được phát hiện lần đầu tiên ở nước ta vào tháng 09/1999 tại Trạm Thực Nghiệm Cao Su Lai Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Do bệnh là đối tượng kiểm dịch loại 2, nên khi vừa phát hiện, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam, cùng với Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Vùng II và Tổng Công Ty Cao Su Việt Nam đã thống nhất loại bỏ tất cả những dvt mẫn cảm nhằm dập tắt nguồn bệnh ngay từ ban đầu (Tổng Công Ty Cao Su Việt Nam, 2004). Những nghiên cứu về bệnh rụng lá Corynespora ở Việt Nam hiện nay mới chỉ dừng lại ở việc quan sát đánh giá tình hình bệnh, kiểm tra tính kháng của một số dvt cao su. Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu về C. cassiicola chưa nhiều. 25 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 3.1.1. Thời gian Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 03/2005 đến tháng 08/2005. 3.1.2. Địa điểm - Thu thập một số mẫu trên đồng ruộng, tiến hành tại Bến Cát, Bình Dương và An Lộc, Đồng Nai. - Tiến hành phân lập C. cassiicola tại phòng thí nghiệm Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật,Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam - Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương. - Tiến hành phân tích RFLP - PCR tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Và Thí Nghiệm Hoá Sinh Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. 3.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu Một số mẫu lá cao su thuộc các dvt cao su khác nhau có biểu hiện các triệu chứng đặc trưng và không đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora. 3.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Phân lập nguồn nấm C. cassiicola 3.2.2.1. Hóa chất và dụng cụ Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, pence, lame, lamelle, giá đỡ ống nghiệm, becher, kính hiển vi quang học, nồi hấp Tommy, tủ sấy, hộp đựng mẫu, giấy thấm nước, bút lông… Môi trường PSA hoặc PDA (tự pha chế theo công thức do Chee đề xuất năm 1988). Thuốc nhuộm Methylene blue. Thành phần môi trƣờng PSA: Khoai tây 100 g 26 Đường sucrose 10 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml Thành phần môi trƣờng PDA: Khoai tây 200 g Đường glucose 2 0 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml Cách nấu môi trƣờng PSA: Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 100g, thái nhỏ hạt lựu, thêm 500 ml nước cất 2 lần đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong. Thêm 15g agar và 500 ml nước cất vào dung dịch đã lọc. Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml và thêm 10g đường sucrose. Đun sôi trong 30 phút, khuấy đều trong lúc nấu. Phân vào các ống nghiệm (10 ml/ ống) và đem hấp khử trùng ở 121 C/ 15 phút. Môi trường PDA được thực hiện tương tự như môi trường PSA. 3.2.2.2.Phƣơng pháp lấy mẫu Mẫu được lấy vào buổi sáng sớm khi độ ẩm không khí còn cao, bào tử còn nằm trên lá và chưa phát tán vào không khí. Thông thường, mẫu được lấy trước 8h sáng. Mẫu được ghi rõ tên dvt lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, lá non hay lá già, vết bệnh đặc trưng hay không đặc trưng. Mẫu lá bệnh được đặt vào hộp có đặt giấy thấm nước để giữ ẩm. 3.2.2.3.Phƣơng pháp phân lập Mẫu nấm được phân lập từ vết bệnh đặc trưng hoặc không đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora. Cách thực hiện như sau: Lấy lá bệnh đưa về phòng thí nghiệm, rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần, dùng que cấy nấm đã khử trùng ướt và khô, sau đó đốt trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội lấy trực tiếp bào tử ngay trên vết bệnh cấy vào đĩa môi trường (5 điểm/đĩa). Phương pháp phân lập từ một bào tử, sau hai ngày những khuẩn lạc nghi ngờ là nấm C. cassiicola được cấy sang đĩa môi trường 27 mới (môi trường PDA) và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang 12h/ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng (26 - 30ºC). Khi nấm phát triển, tiến hành cấy chuyền sang môi trường mới cho đến khi thu được nguồn nấm thuần chủng. Trong phân lập nấm C. cassiicola thường lấy bào tử ở mặt dưới của phiến lá. Bề mặt dưới của phiến lá là nơi thuận lợi cho sự phát triển của nấm hơn bề mặt trên của lá. Tầng cutin mỏng giúp nấm xâm nhập vào mô lá dễ dàng hơn, nấm ít chịu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường, đặc biệt là tia tử ngoại của ánh sáng mặt trời. Sử dụng phương pháp phân lập như trên có thể thu nhận được nguồn nấm C. cassiicola đơn bào tử. Tuy nhiên, cần lưu ý là phương pháp này chỉ thực hiện được đối với nấm C. cassiicola do kích thước của bào tử nấm C. cassiicola tương đối lớn. Với phương pháp phân lập như trên, sau khi phân lập các mẫu nấm cần phải được kiểm tra lại bằng cách quan sát hình thái sợi nấm và bào tử của nấm C. cassiicola dưới kính hiển vi. Nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử trên môi trường nhân tạo, để tạo được bào tử C. cassiicola trên môi trường nhân tạo có thể tiến hành theo phương pháp sau. Phƣơng pháp tạo bào tử nấm C. cassiicola nấm trên môi trƣờng PSA Các mẫu nấm sau khi thuần được cấy vào đĩa Petri có chứa 10 ml môi trường PSA. Nuôi cấy trong điều kiện tối liên tục 24/24h ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày. Sau 5 ngày nuôi cấy sử dụng một tấm lame vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử. Tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng hoàn toàn 24/24h ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau thời gian trên tiến hành kiểm tra lại nguồn nấm bằng cách soi bào tử dưới kính hiển vi (đặt bào tử trong giọt nước cất hoặc giọt dung dịch methylene blue). Hình dạng bào tử được so sánh với những mô tả của Ellis và Holiday (1971). Các nguồn nấm được xác định chính xác là nấm C. cassiicola sẽ được sử dụng vào những phân tích tiếp theo. 3.2.2. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR 3.2.2.1. Chuẩn bị DNA khuôn mẫu cho phản ứng PCR 28 Các dòng nấm C. cassiicola sau khi đã phân lập thuần đƣợc chuyển sang môi trƣờng lỏng, tiến hành nuôi cấy trên máy lắc (160 vòng/phút), điều kiện nhiệt độ 26 - 30 C. Sau 4 ngày tiến hành thu sinh khối sợi nấm. Cần lƣu ý là sợi nấm phải khô và nên giữ nguồn sợi nấm ở -70 C. Hóa chất và dụng cụ ly trích - Becher, phễu lọc, giấy thấm, nitơ lỏng, phenol, chloroform, isoamyl alcohol, lysis buffer, isopropanol, TE 1X, ethanol 100%, ethanol 70%. - Cối và chày để nghiền mẫu, eppendorf, micropipette và các loại đầu tip, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex. Phương pháp ly trích Khuôn mẫu cho phản ứng PCR là DNA của sợi nấm của các mẫu phân lập được. Phương pháp ly trích DNA được thực hiện theo quy trình của Lee & Taylor (1990). Quy trình ly trích DNA tổng số nấm C. cassiicola 1) Nuôi trong môi trường lỏng. 2) Giữ sợi nấm ở - 70 C. 3) Lấy 1g sợi nấm khô kiệt vào cối và nghiền trong dung dịch nitơ lỏng. 4) Chuyển phần bột nấm vào ống eppendorf. Ở bước này, cố gắng giữ cho bột nấm được nghiền không tan. 5) Thêm 400 l lysis buffer, trộn đều hỗn hợp. 6) Ủ ở 65 C trong 1 giờ. 7) Di chuyển ống nghiệm ra khỏi dung dịch nước ấm (ra khỏi bồn ủ nhiệt). 8) Thêm vào 300 l phenol: chlorophorm và isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ (lúc này dung dịch có màu trắng đục). Ly tâm 14 000 vòng trong 1 phút ở 28 C. 9) Chuyển phần trên ống eppendorf sang một eppendorf khác với thể tích 300 l và kết tủa DNA bằng cách thêm vào ½ thể tích isopropanol, trộn nhẹ và cẩn thận. DNA sẽ kết tủa dạng sợi màu trắng đục. 29 10) Ly tâm 14 000 vòng trong 1 phút ở 28 C. 11) Cẩn thận đổ bỏ phần dịch lỏng. Dùng ethanol 70 % rửa sạch nhiều lần DNA. 12) Làm khô DNA, hoà tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở 4 C hay – 20 C cho đến khi sử dụng 3.2.2.2 Thực hiện phản ứng PCR Hóa chất và dụng cụ Các primer: 2 primer được sử dụng trong nghiên cứu là ITS A và ITS B được mô tả bởi Silva và cộng sự (1998), hai primer này được thiết kế để khuếch đại một đoạn DNA có kích thước 540 nằm trong vùng ITS 1 và ITS 2 của nấm C. cassiicola. Trình tự của các primer ITS A và ITS B như sau: Primer Trình tự 5’- 3’ ITS A GGGAATTCTCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS B GCAAGCTTTCCTCCGCTTATTGATATGC Hoá chất, các enzyme và dung dịch dùng trong phản ứng PCR và điện di: Taq DNA polymerase (Biorad). PCR buffer(Biorad). dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) (Biorad). MgCl 2 (Biorad). DNA ladder. (Biorad). Ethidium bromide. Dịch đệm TAE 0,5X. Loading buffer 6X, gel agarose. Dụng cụ thí nghiệm: Eppendorf các loại: 0.2ml, 0.5 ml, 1.5ml. Micropippette và các đầu típ. Lò vi sóng. Cân kỹ thuật 4 số. Máy điện di (electrophoresis) (Mini-Subgel, Biorad). UV transilluminator (Biorad). . region) (http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm). Hình 2. 3: Sơ đồ vùng ITS ở nấm. Ghi ch : LSU: large subunit SSU: small subunit IGS: intergenic spacer Nguồn: http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm. dvt cao su kháng bệnh trở nên dễ dàng hơn (Silva và cộng sự, 200 3). Những khác biệt về di truyền của nấm bệnh C. cassiicola trên ký chủ khác nhau đã được nghiên cứu bằng phân tích đa hình RFLP. phân giải cellulose ngoài cơ chế biến dưỡng độc tố (C.K. Jayashinge, 200 0). 23 Nghiên cứu biến dị di truyền của 42 isolates nấm C. cassiicola trên các ký chủ khác nhau bằng phương pháp