Tài liệu Phân tích đa dạng di truyền một số ISOLATES vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc (Ralstonia solanacearum Smith) và tuyển chọn giống kháng bệnh docx
PHÂNTÍCH ĐA DẠNGDITRUYỀN MỘT SỐISOLATESVIKHUẨN
GÂY BỆNHHÉOXANHHẠILẠC(RalstoniasolanacearumSmith)
VÀ TUYỂNCHỌNGIỐNGKHÁNGBỆNH
Nguyn Th Vân, Nguyn Th Bình,
Nguyn Huy Chung, Lê Tun Tú,
Nguyn Mnh Hùng, inh Th Phòng,
Tin Phát
Summary
Analyzing genetic polymorphism of isolates of groundnut bacterial wilt disease agent
Ralstonia solanacearum Smith and selection of varieties resistant to disease
A number of plant pathogenic isolates of R. solanacearum Smith derived from various groundnut
growing provinces in Northern Vietnam have been identified and analyzed. Of 11 isolates analyzing
their DNA polymorphism there are 10 primers gave the better characterization data at molecular
basis. Primary result of the DNA analysis has showed significant polymorphism of plant pathogen
R. solanacearum Smith indicating wider host plant range and will serve as the scientific platform for
further breeding and selection of disease resistant cultivars. The genetic similarity index of those
strains of bacterium R. solanacearum Smith showed a certain molecular variation between them,
ranging from 2% to 34%.
It has been screened 94 groundnut lines/varieties against bacterial wilt and selected 2 varieties
with highly resistance; 3 with moderate resistance and 10 with a little susceptible to bacterial wilt
disease. Among those tested lines/varieties of groundnut, the promising variety TK 10 has showed
the best performance in disease resistance, grain yield, good adaptation, and seed quality
compared to common variety MD7.
Key word: Groundnut, Ralstonia solanacearum, PCR - RADP, polymorphism analysis, plant
resistance
I. T VN
Bnh héoxanh hi lc ưc xác nh là
do vi khuNn Ralstonia solanacearum Smith
gây ra, là mt trong nhng bnh gây tn
tht khá ln cho các vùng sn xut lc
hu ht các nưc trên th gii. Vit N am
bnh có th làm gim năng sut t 5% -
80%, Trung Quc bnh có th làm mt
năng sut hoàn toàn, Indonesia t 5% -
65%, Thái Lan trên 50%.
Do mc nguy hi ca bnh nên
nhiu cơ quan như Vin Khoa hc K thut
N ông nghip Vit N am, Vin Bo v thc
vt, Vin Di truyn N ông nghip, Trưng
i hc N ông nghip I Hà N i và Vin
Công ngh sinh hc ã nghiên cu nh
hưng ca bnh n năng sut lc, tuyn
chn ngun gen kháng, nghiên cu a dng
di truyn ca ngun ký sinh gây bnh mt
s vùng trng im sn xut lc Vit
N am. Trong nhng năm gn ây B môn
Min dch thc vt Vin Bo v thc vt ã
tin hành phântích a dng di truyn ca
mt s isolatesvi khuNn héoxanh lc thu
thp t nhiu vùng sinh thái khác nhau, da
trên cơ s ó tuyn chn gen kháng bnh
phc v cho chn to ging kháng bnh.
II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CU
1. Vật liệu
- Mu vi khuNn: Bao gm 11 isolatesvi
khuNn Ralstonia solanacearum Smith gây
bnh héoxanh lc ưc phân lp ti Vin
Bo v thc vt. Các mu bnh ưc thu
thp t Hà Tây, Bc Giang, Hi Phòng,
Ninh Bình, Hòa Bình và Ngh An.
- Hoá chất và thiết bị máy móc: máy o
quang ph Diod Array Spectrophotometer
(M), máy ly tâm Avanti
TM
30, máy PCR
- Thermal Cycler PTC 100, Tag
ADNpolymeraza (Perkin - Elmer) và các
hoá cht nghiên cu sinh hc phân t khác.
- Các mồi sử dụng trong phản ứng
RADP: Trình t ca 10 mi s dng trong
phn ng RADP ưc th hin trong bng 1.
Bảng 1. Trình tự các nucleotide của 10 mồi được sử dụng trong nghiên cứu.
Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi
1.OPF10 5’GGAAGCTTGG3’ 6.OPQ13 5’GGAGTGGACA3’
2.OPH04 5’GGAAGTCGCC3’ 7.RA142 5’CAATCGCCGT3’
3.OPN05 5’ACTGAACGCC3’ 8.RA143 5’TCGGCGATAG3’
4.OPP15 5’GGAAGCCAAC3’ 9.RA31 5’AACCGACGGG3’
5.OPP19 5’GGGAAGGACA3’ 10.RA46 5’CCAGACCCTG3’
94 mu ging lc ánh giá kh năng
kháng bnh HXVK ưc cung cp t Trung
tâm Tài nguyên di truyn thc vt, t ngun
ging nhp ni và mt s ging ang phát
trin trong sn xut.
2. Phương pháp nghiên cứu
- Phântích a dng di truyn các isolates
vi khuNn bng phương pháp RADP. Tách
chit ADN tng s da theo phương pháp ca
Murray và Thompson, 1980 có ci tin. Phân
tích s liu theo qui ưc: 1 = phân on ADN
xut hin, 0 = phân on ADN không xut
hin, khi in di sn phNm RAPD vi các
on mi ngu nhiên. Xác nh h s di
truyn ging nhau theo phương pháp ca Nei
và Li 1979 (h s di truyn Jacar).
2a
Sij
2a b c
=
+ +
Trong ó: S
ij: H s ging nhau gia
hai cá th i và j; a: S phân on ADN xut
hin c cá th i và j; b: S phân on
ADN xut hin i và không xut hin j;
c: S phân on ADN xut hin j và
không xut hin i.
- Phântích ánh giá h s tương quan
kiu hình theo 3 phương pháp: SM, Dice và
Jaccard và 4 phương pháp phân nhóm:
UPGMA (phân tích các nhóm phân t không
cùng trng lưng), WPGMA (các nhóm phân
t có cùng trng lưng), liên kt hoàn toàn
(complete linkage), liên kt ơn l (single
linkage). Lp biu hình cây da vào giá tr
phân tích ca tương quan kiu hình cao nht
trong chương trình NTSYS
* Hàm lượng thông tin tính đa hình
(Polymorphism Information Content = PIC)
của mỗi cặp mồi xác định theo công thức:
PIC
i
= 1 - ΣP
ij
2
Trong ó: Pij là tn s allen th j ca
kiu gen i ưc kim tra.
-
ánh giá kh năng kháng nhim bnh
trên nn Sicplot theo phương pháp nhim
ht nt nanh. i chng là ging chuNn
nhim quc t: ICGV 3704 và ging chuNn
kháng là MD7 ti nhà lưi - Vin Bo v
thc vt. ánh giá kh năng kháng nhim
bnh HXVK ca các mu ging theo thang
im 6 cp, t kháng cao n nhim nng.
III. KT QU VÀ THO LUN
1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái
vi khun gâybệnhhéoxanh
c im ca khuNn lc vi khuNn gây
bnh héoxanh trên môi trưng TZC là có
dng tròn không u, màu hng, tâm màu
. Trên môi trưng SPA u có khuNn lc
màu trng sa. Nhit thích hp nht cho
khuNn lc phát trin t 28 - 30
0
C.
Hình 1. KhuNn lc vi khuNn héoxanh trên
môi trưng TZC
Căn c vào c im hình thái ca
khuNn lc có th kt lun 11 isolatesvi
khuNn này là vi khuNn héoxanh hi lc
Ralstonia solanacearum.
2. Kết quả nghiên cứu đa dạngditruyền
các isolatesvi khun héoxanhlạc
ADN ca 11 issolates vi khuNn ã ưc
phân tích vi 10 mi ngu nhiên. ánh giá
tính a hình thông qua giá tr PIC (giá tr
PIC càng ln thì tính a hình ca cp mi
ó càng cao), khong cách di truyn gia
các isolates ưc xác nh thông qua h s
tương ng vàsơ hình cây.
Tng s phân on ADN ca 11
isolates vi khuNn khi phântích vi 10 mi
ngu nhiên là 83 phân on. Trong ó s
phân on a hình là 41 phân on (chim
49%) và không a hình là 42 phân on
(51%). Mi OPF10 cho tính a hình cao
nht (100%), hai mi OPQ13 và RA143
không cho tính a hình (0%).
Kt qu này cũng phù hp khi phântích
hàm lưng thông tin a hình bng giá tr
PIC (bng 2): Giá tr PIC ca mi OPQ13
và RA143 là 0 (không a hình) và giá tr
PIC ca mi OPF10 là 0,74 (a hình cao
nht).
Bảng 2. Hàm lượng thông tin tính đa hình (PIC) của 11 isolatesvi khun
STT Tên mồi PIC STT Tên mồi PIC
1 OPF10 0,74 6 OPQ13 0,00
2 OPH04 0,37 7 RA142 0,37
3 OPN05 0,44 8 RA143 0,00
4 OPP15 0,45 9 RA31 0,48
5 OPP19 0,46 10 RA46 0,32
Kt qu cho thy phn ln các mi u
cho tính a hình không cao (PIC < 0,5) mc
dù vy vi 10 cp mi RAPD ngu nhiên
này cũng ã cho thy tính a hình ADN ca
11 isolatesvi khuNn Ralstonia solanacearum
mà chúng tôi nghiên cu.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
OPP19
400bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
OPH04
1500bp
250bp
1500bp
M. Thang AD chun 1000bp; thứ tự từ 1 - 11 ứng với các chủng P1 - P11
Hình 2. Kết quả điện di sản phm RAPD của các isolatesvi khun
với mồi OPP19, OPH04, OPF10 và RA46
Các s liu phântích PCR - RAPD
ưc x lý vàphântích trong chương trình
NTSYSpc version 2.0 nhm tìm ra khong
cách di truyn gia các mu khuNn nghiên
cu thông qua h s tương ng di truyn
và biu hình cây (hình 2).
kim tra phương pháp phân nhóm,
chúng tôi ã tin hành xác nh giá tr tương
quan kiu hình theo ba phương pháp tính h
s di truyn ging nhau (phương pháp ca
Jaccard, ca N ei & Li, ca Sokal) vi bn
kiu phân nhóm (WPGMA, UPGMA, liên kt
hoàn toàn và liên kt ơn l) (bng 3). Biu
hình cây ưc thit lp da trên giá tr tương
quan cao nht vi các giá tr khi r ≥ 0,9:
Tương quan rt cht, r = 0,8 - 0,9: Tương
quan cht, r = 0,7 - 0,8: Tương quan tương
i cht, r≤0,7: Tương quan không cht.
Bảng 3. Giá trị tương quan kiểu hình (r)
UPGMA WPGMA Liên kết hoàn toàn Liên kết đơn lẻ
SM 0.97723 0.97207 0.97390 0.97437
Dice 0.97677 0.96398 0.96398 0.97412
Jaccard 0.97982 0.97390 0.96624 0.97704
Kt qu cho thy, vi ba cách tính h s
di truyn ging nhau và bn kiu phân nhóm
u phn ánh mi tương quan kiu hình ca
11 mu vi khuNn héoxanh lc là rt cht (h
s r t t 0.96398 ti 0.97982). Trong ó
giá tr tương quan kiu hình (r) ln nht
0.97982 khi tính theo h s di truyn Jaccard
và kiu phân nhóm UPGMA. Vì vy, sơ
hình cây ưc thit lp theo h s di truyn
ging nhau Jaccard và kiu phân nhóm
UPGMA. Các s liu phântích PCR -
RAPD ưc x lý vàphântích trong chương
trình NTSYSpc version 2.0 nhm tìm ra
khong cách di truyn gia các mu khuNn
nghiên cu thông qua h s tương ng di
truyn và biu hình cây (hình 2).
Hình 3. Biểu đồ hình cây về mối quan hệ ditruyền của các isolatesvi khun theo hệ số
của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA.
Phân tích s sai khác v h s di truyn
ca 11 isolatesvi khuNn vi 10 mi ngu
nhiên chia thành 2 nhánh cây chính: N hánh 1
ch có mt isolates P1, có s sai khác so vi
10 isolatesvi khuNn còn li là 34%. N hánh
còn li bao gm 10 isolates P2, P3, P4, P5,
P6, P7, P8, P9, P10 và P11, trong ó bn
isolates (P2, P6, P7, P9) không có s khác
nhau v mt di truyn, 6 mu còn li có s
sai khác di truyn t 2% (P5) ti 18% (P4).
3. Đánh giá tính khángbệnhhéoxanhvi
khun của các giốnglạc
Kt qu nghiên cu 94 dòng ging lc
cho thy ch có 2 ging kháng t 2,1%
(TK10, LH3 - 1 - 1); Kháng trung bình có 3
ging chim 3,2% (Sen N gh An ), còn li
ch yu là các ging nhim 50 ging chim
53,2% và nhim nng 29 ging chim
36,9%. Da vào kt qu ánh giá trên
chúng tôi ã tuyn chn, ánh giá ging lc
TK10 có ngun gc nhp ni t Trung
Quc và sn xut th nghim vi din tích
2 ha nơi thưng xuyên din ra dch hi ti
hp tác xã Sơn ông - Th xã Sơn Tây - Hà
Tây. Bưc u cho thy dòng ưc tuyn
chn t ging TK10 có c tính nông hc
tt, có kh năng kháng bnh HXVK trên
vùng t chuyên canh gò i có ngun bnh
HXVK nng trong v xuân và v thu ông
2007 tương ương ging MD7 và hơn hn
ging a phương, ưc nông dân ánh giá
cao, N ăng sut trung bình v xuân t 26 -
33 t/ha.
IV. KT LUN
1. Kt qu phântích a dng di truyn
ca 11 isolatesvi khuNn héoxanh cho thy
ã có tính a hình mc phân t. Các
mu isolates P1 thu thp ông Phương
Yên - Hà Tây có s khác bit di truyn rõ
rt so vi 10 chng còn li. Bn isolates P2,
P6, P7, P9 không có s sai khác v mt di
truyn khi phântích bng 10 mi ngu
nhiên trong nghiên cu này.
2. ã ánh giá ưc kh năng kháng
bnh HXVK ca 94 dòng ging lc trong
ó có 2 ging kháng (TK10, LH3 - 1 - 1), 3
ging kháng trung bình (Sen N gh An ),
10 ging nhim trung bình, 50 ging nhim,
29 ging nhim nng.
3. Ging lc TK10 nhp ni t Trung
Quc có tim năng năng sut cao, kháng
bnh HXVK, bưc u ã ưc sn xut
th nghim trên vùng dch bnh t năng
sut t 26 - 33 t/ha, cn nhân rng ra sn
xut phc v cho nhiu vùng dch bnh
khác hin ang s dng ging nhim bnh.
TÀI LIU THAM KHO
1 Đỗ Tấn Dũng, 1999. Nghiên cu bnh
héo xanhvi khuNn hi mt s cây trng
cn ngoi thành Hà N i và vùng ph
cn, Lun án Tin sĩ khoa hc N ông
nghip, Trưng HN N I, Hà N i.
2 Đoàn Thị Thanh, guyễn Xuân Hồng,
Vũ Triệu Mân. 1995. N ghiên cu vi
khuNn Pseudomonas solanacearum trên
mt s cây ký ch min Bc - Vit
N am. Tuyn tp công trình nghiên cu
ca nghiên cu sinh, Quyn 5, N XB
N ông nghip, Hà N i.
3 Lê Lương Tề, 1997. Bnh héoxanhvi
khuNn Ralstonia solanacearum Smith.
Tp chí BVTV s 6, tr 45 - 46.
4 Hazarika, D.K, Das, K.K, 1999. Incidence
of bacterial wilt of Sesamum in relation to
diffeirent sowing dates and varieties.
Plant Disease Reseach, 14: 2, 130 - 135.
5 .W.Schaad, J.B.Jones and W. Chun,
1999. Plant Pathogenic Bacteria
gười phản biện: guyễn Văn Tuất
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7
. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ ISOLATES VI KHUẨN
GÂY BỆNH HÉO XANH HẠI LẠC (Ralstonia solanacearum Smith)
VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG KHÁNG BỆNH
Nguyn.
Ralstonia solanacearum.
2. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền
các isolates vi khun héo xanh lạc
ADN ca 11 issolates vi khuNn ã ưc
phân tích vi