PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƯƠNG) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGÔ QUANG HƢỞNG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGÔ QUANG HƢỞNG ThS. PHAN THÀNH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** STUDYING GENETIC DEVERSITY OF Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei POPULATION, DESTRUCTIVE FUNGAL PATHOGEN OF Hevea brasiliensis Muell. Arg. AT LAI KHE (BEN CAT – BINH DUONG), WAS CARRIED OUT BY USING RFLP – PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD. BUI CACH TUYEN NGO QUANG HUONG MSc. PHAN THANH DUNG Term: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS. Bùi Cách Tuyến - hiệu trưởng trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. ThS. Phan Thành Dũng - trưởng Bộ môn bảo vệ thực vật, Viện nghiên cứu cao su Việt Nam. Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. - Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . - KS. Nguyễn Ngọc Mai, KS. Vũ Thị Quỳnh Chi cùng tập thể cô chú, anh chị làm việc tại Bộ môn bảo vệ thực vật - Viện nghiên cứu cao su Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. - ThS. Nguyễn Văn Cường cùng các anh chị làm việc tại Trung tâm phân tích thí nghiệm hoá sinh - Đại học Nông Lâm TP. HCM đã giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt khóa luận . Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 28 - Trường ĐH. Nông Lâm TP. HCM đã luôn ở bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẽ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận. Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời, để Con đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006. Sinh viên Ngô Quang Hưởng. TÓM TẮT NGÔ QUANG HƢỞNG, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) bằng kỹ thuật RFLP – PCR”. Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến ThS. Phan Thành Dũng Thời gian thực hiện từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006, tại Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương và tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Vấn đề bảo vệ thực vật luôn nhận được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội. Đối với một nước sản xuất cao su thiên nhiên như Việt Nam, những nghiên cứu về vi sinh vật, côn trùng, sâu hại trên cây cao su là vô cùng cấp thiết. Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra là một bệnh mới và vô cùng nguy hiểm. Nó gây ra những thiệt hại rất lớn về kinh tế. Để tạo những tiền đề cho các nghiên cứu về loại bệnh này, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP – PCR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể nấm C. cassiicola tại Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương. Nôi dung nghiên cứu: - Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Corynespora cassiicola. - Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS bằng 2 primer ITS A và ITS B. - Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR thu được. Các kết quả đạt được: - Phân lập được 65 dòng nấm và tách đơn bào tử 24 dòng nấm C. cassiicolai trên các dòng vô tính cao su khác nhau. - Dùng PCR khuếch đại được vùng gene nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S và đầu 5’ của rDNA 28S, với kích thước là 540 bp. - Phân cắt sản phẩm PCR với 7 loại enzyme cắt là Hae III, Sau3A I, EcoR I, Nde II, Cfo I, Rsa I, Alu I. Kết quả là không tìm thấy băng đa hình khi cắt bằng 7 loại enzyme trên. Việc sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa dạng di truyền nấm C. cassiicola chưa cho kết quả như mong muốn. Không tìm thấy bất cứ sự khác biệt nào khi phân cắt bằng 7 loại enzyme trên. Do đó, cần có những nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự để có những kết luận chính xác về mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm này. MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt x Danh sách các bảng xi Danh sách các hình xii 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg 3 2.1.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg trên thế giới và tại Việt Nam 3 2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng mưa, tốc độ gió đến sự phát triển của cây cao su 4 2.1.3. Tình hình bệnh hại trên cây cao su 5 2.2. Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 6 2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt. ) Wei 6 2.2.2. Đặc điểm phân loại học của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 6 2.2.3. Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 7 2.2.4. Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố và triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora 8 2.2.5. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nước trồng nhiều cao su trên thế giới 9 2.3. Giới thiệu về phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 10 2.3.1. Sơ lược về kỹ thuật PCR 10 2.3.2. Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR 10 2.3.3.1. DNA mẫu 10 2.3.3.2. Primer và nhiệt độ lai 11 2.3.3.3. Enzyme 12 2.3.3.4. Mg 2+ 12 2.3.3.5. dNTPs 12 2.3.3.6. Số lượng chu kỳ 12 2.3.3.7. Nhiệt độ và pH 13 2.3.3.8. Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR 13 2.3.4. Các bước thực hiện một phản ứng PCR 13 2.3.5. Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR 14 2.3.6. Ứng dụng của kỹ thuật PCR 14 2.4. Giới thiệu về kỹ thuật RFLP 15 2.4.1. Sơ lược về enzyme cắt giới hạn 15 2.4.1.1. Giới thiệu chung 15 2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn 15 2.4.1.3. Các loại RE 16 2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE 17 2.4.2. Sơ lược về phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) 17 2.4.2.1. Giới thiệu chung 17 2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP 17 2.4.2.3. Sơ lược về kỹ thuật RFLP – PCR 18 2.6. Giới thiệu về vùng ITS 19 2.7. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nước và ngoài nước 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 22 3.1.1. Thời gian 22 3.1.2. Địa điểm 22 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu 22 3.2. Nội dung nghiên cứu 22 3.3. Vật liệu và phương pháp 22 3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối 22 3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 22 3.3.1.2. Phương pháp lấy mẫu 23 3.3.1.3. Phương pháp phân lập nấm 23 3.3.1.4. Phương pháp tách đơn bào tử 23 3.3.1.5. Phương pháp nhân sinh khối 24 3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA của nấm 24 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 24 3.3.2.2. Phương pháp tách chiết DNA 24 3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di 25 3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích 25 3.3.2. Khuếch đại vùng ITS của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei bằng kỹ thuật PCR 26 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 26 3.3.2.2. Thực hiện phản ứng PCR 26 3.3.2.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di 27 3.3.3. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 28 3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 28 3.3.3.2. Thực hiện phân tích RFLP 28 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola trên một số dòng vô tính cao su 29 4.1.1. Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora 29 4.1.2. Kết quả phân lập 32 4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử 32 4.1.4. Kết quả nhân sinh khối 35 4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm 36 4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR 37 4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola 40 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1. Kết luận 46 5.2. Đề nghị 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 7. PHỤ LỤC 52 [...]... – Bình Dƣơng) bằng phƣơng pháp RFLP – PCR 1.2 Mục đích yêu cầu - Phân lập thành công các dòng nấm gây bệnh trên các dòng vô tính cây cao su khác nhau - Đánh giá được sự sai khác về mặt di truyền của một số dòng nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei phân lập từ các dòng vô tính cao su khác nhau bằng kỹ thuật RFLP – PCR 1.3 Yêu cầu - Phân biệt được bệnh do nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.). .. phân tử của nấm C cassiicola tại Việt Nam, đồng thời được sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, của thầy PGS.TS Bùi Cách Tuyến, ThS Phan Thành Dũng và đặc biệt là sự giúp đỡ của Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, tôi thực hiện đề tài: Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell Arg) tại Lai Khê (Bến Cát –. .. Curt.) Wei gây ra trên cây cao su với những bệnh do các nấm khác - Nắm vững quy trình nuôi cấy, phân lập và tách đơn bào tử nấm C cassiicola - Nắm vững quy trình kỹ thuật PCR và kỹ thuật RFLP PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell Arg 2.1.1 Sơ lƣợc về cây cao su Hevea brasiliensis Mull Arg trên thế giới và tại Việt Nam Cây cao su có tên khoa học là Hevea brasiliensis. .. có 24 loại bệnh gây hại trên cây cao su ở Việt Nam 2.2 Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 2.2.1 Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei Do nấm Corynespora có phổ ký chủ rộng nên đã có rất nhiều nhà khoa học tìm thấy loại nấm này trên nhiều ký chủ khác nhau Đầu tiên, vào năm 1896 nó Cooke phát hiện nấm này trên cây dưa leo và cây dưa hấu tại Mỹ, đặt... nhất là bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây ra (Báo cáo tại hội thảo chuyên đề “Bảo vệ thực vật cây Cao su Việt nam - Hợp tác nghiên cứu và đào tạo giữa Đại học Nông Lâm và Ngành Cao su Việt Nam” – Phan Thành Dũng, 2006) Bệnh rụng lá Corynespora là một bệnh mới, mức độ tàn phá của nó trên cây cao su và nhiều loại cây trồng khác là vô cùng lớn Ngoài các bệnh do... Corynespora cassiicola gây bệnh trên rất nhiều loại ký chủ và trên phạm vi toàn thế giới Nấm tấn công nhiều loại cây trồng từ các cây rau màu như rau di p, dưa gang, cà chua hay các cây công nghiệp như đu đủ, cao su, cây gai…Trong đó, nấm Corynespora cassiicola gây bệnh trên cây cao su mang tính chuyên biệt cao Do khả năng thích ứng rất lớn đối với thời tiết mà bệnh do nấm này gây ra đã được ghi nhận... Sinh – Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM 3.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu lá của các dòng vô tính cao su có triệu chứng bệnh rụng lá Corynespora 3.2 Nội dung nghiên cứu 1 Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola 2 Sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS 3 Phân tích đa dạng di truyền của nấm C cassiicola bằng kỹ thuật RFLP – PCR 3.3 Vật liệu và phƣơng pháp. .. do vi sinh vật gây ra, trên cây cao su còn có các bệnh do côn trùng gây ra Các loại côn trùng gây hại cây cao su có thể kể đến như: mối, sâu, sùng hại rễ, nhện, ốc sên, rệp… (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004) Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài có tầm quan trọng về kinh tế (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng,... gây hại Hiện nay, trên cây cao su có rất nhiều bệnh như bệnh về lá, bệnh về thân cành, bệnh rễ (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004) Các bệnh này ảnh hưởng rất lớn đến sản lượng và phẩm chất mủ Đặc biệt là các bệnh về lá như bệnh phấn trắng do nấm Oidium heveae Steinm gây ra, bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) gây ra, bệnh rụng lá mùa mưa do nấm. .. thời nấm Corynespora cassiicola có khả năng biến đổi sinh hóa rất lớn Bệnh này làm rụng lá trên quy mô lớn ảnh hưởng đến năng su t mủ của cây cao su Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên trên cây cao su vào tháng 9/1999 tại các nông trường cao su ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên Nó đã gây ra cho ngành cao su những mối lo mới và ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của ngành cao su Lúc mới xuất hiện, bệnh . PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt. ) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg .) TẠI. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt. ) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg .) TẠI