Luận văn : PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƯƠNG) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR part 3 pdf

4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử Để chuẩn bị tốt nguồn nấm cho các thí nghiệm kế tiếp, tôi đã tiến hành tách đơn bào tử với mục đích tạo ra khuẩn lạc đồng nhất về mặt di truyền. Do bào tử của nấm Corynespora cassiicola có kích thước lớn nên có thể quan sát và tiến hành tách đơn bào tử rất dễ dàng trên kính hiển vi quang học. Bảng 4.2: Các dòng nấm đƣợc tách đơn bào tử STT đƣợc mã hóa Kí hiệu của dòng vô tính cao su Tên dòng vô tính cao su 1 RRIV2 LH82/122 3 26/20 LH9/0023 6 29/93 LH99/0053 7A 4/48 LH99/0081 7B 4/48 LH99/0081 11 28/37 LH99/0093 12 19/38 LH99/0098 14 4/84 LH99/0131 19 32/86 LH99/0337 23 1/24 LH99/0374 28 2/55 LH99/0412 30 30/88 LH99/0431 35 21/55 LH99/0617 42 7/70 LH99/0679 52 19/82S LH99/0050 53 29/93S LH99/0053 54 28/81S LH99/0112 55 22/25S LH99/0216 59 7/8S LH99/0636 60 22/70S LH99/0675 62 10/11S LH99/0757 63 10/34S LH99/0778 64 16/28S LH99/0672 65 RRIV4 Nấm Corynespora cassiicola là một loại nấm rất khó phát sinh bào tử trên môi trường nhân tạo (có thể do môi trường nuôi cấy chưa thích hợp hoặc do chế độ ánh sáng không thích hợp). Do đó, để có bào tử chúng tôi đã tiến hành kích thích cho nấm này phát sinh bào tử bằng cách: - Tạo vết thương trên bề mặt khuẩn lạc bằng kim lưỡi mác hoặc lame vô trùng. - Sau đó tiến hành ủ khuẩn lạc trong tối 3 ngày. - Rồi đem khuẩn lạc chiếu sáng 3 ngày liên tiếp, khuẩn lạc sẽ phát sinh bào tử. Bào tử nấm Corynespora cassiicola có màu nâu nhạt, hình bầu dục, nhiều vách ngăn, chiều dài biến thiên (có thể dài tới 700 m) (Phan Thành Dũng, 2004; Nguyễn Thị Huệ, 1997). Chúng tôi đã tiến hành tách đơn bào theo quy trình ở Mục 3.3.1.4. Tuy nhiên, do một số nguyên nhân như số lượng mẫu lớn, nấm khó sinh bào tử trên môi trường nhân tạo, thời gian thực hiện ngắn… nên chúng tôi chỉ tiến hành tách thành công được một số dòng nấm (xem Bảng 4.2). Đồng thời trong quá trình tách đơn bào tử, tôi nhận thấy khuẩn lạc hình thành từ 2 đơn bào tử của một số dòng nấm có nhiều điểm khác nhau như hình dạng, kích thước, màu sắc (Hình 4.4). Như vậy rất có thể có nhiều dòng nấm cùng ký sinh trên một ký chủ tại thời điểm phân lập nấm nhưng cũng có thể chỉ là sự thay đổi màu sắc khuẩn lạc của một dòng nấm. Chúng tôi đã mã hóa hai khuẩn lạc (có màu sắc) thu được từ một dòng nấm thành hai dòng khác nhau để đánh giá sự khác biệt về mặt di truyền. Và ký hiệu là A và B. Hình 4.4: Sự khác biệt giữa 2 khuẩn lạc thu đƣợc từ 2 đơn bào tử của một dòng nấm 7A 7B 4.1.3. Kết quả nhân sinh khối Bào tử thu được sau khi tách đơn bào tử sẽ phát triển thành khuẩn lạc. Tiến hành chuyển sinh khối sợi nấm từ đĩa petri sang bình tam giác để tăng nhanh sinh khối. Các bình tam giác này chứa môi trường PGA lỏng và được lắc ở 160 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 o C. Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi sinh khối đã đạt được lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối (Hình 4.5). Hình 4.5: Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc Trong quá trình nhân sinh khối, đã thu nhận được sinh khối có 2 màu khác nhau là màu đen và màu vàng. Có thể giải thích là do chế độ ánh sáng chưa phù hợp nên sinh khối có màu sắc khác nhau. Vấn đề thường gặp trong giai đoạn này là rất dễ bị nhiễm khuẩn, đặc biệt là trong ngày thứ nhất và thứ hai. Tuy theo dõi từng ngày trong quá trình lắc nhưng do lắc liên tục nên rất khó phát hiện bị nhiễm khuẩn trong khi lắc. Để đảm bảo không bị nhiễm khuẩn, trước khi thu sinh khối ta tiến hành quan sát dịch lỏng trên kính hiểu vi quang học để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn (chỉ là phương pháp tương đối). Thông thường, mẫu bị nhiễm khuẩn sẽ bị đục trong khi lắc. 4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm Các dòng nấm Corynespora cassiicola sau khi nhân sinh khối sẽ thu nhận sợi nấm và tiến hành li trích DNA tổng số. DNA của sợi nấm được li trích theo qui trình của Lee & Taylor (1990). Kết quả li trích DNA tổng số cho kết quả khá tốt, số lượng tạp (chủ yếu là RNA, protein) tương đối ít (Hình 4.6). DNA sau khi li trích sẽ được tinh sạch và pha loãng đến mức độ có thể chạy được PCR (band DNA xuất hiện trên gel điện di ở dạng vệt (track)). Hình 4.6: Kết quả li trích của 24 dòng nấm khác nhau Ghi chú: L1: 1 (LH82/122) L6:11 (LH99/0093) L11: 28 (LH99/0412) L2: 3 (LH9/0023) L7: 12 (LH99/0098) L12: 30 (LH99/0431) L3: 6 (LH99/0053) L8: 14 (LH99/0131) L13: 35 (LH99/0617) L4: 7A (LH99/0081) L9: 19 (LH99/0337) L14: 42 (LH99/0679) L5: 7B (LH99/0081) L10: 23 (LH99/0374) L15: 52 (LH99/0050) L16:53 (LH99/0053) L19: 59 (LH99/0636) L22: 63 (LH99/0778) L17: 54 (LH99/0112) L20: 60 (LH99/0675) L23: 64 (LH99/0672) L18: 55 (LH99/0216) L21: 62 (LH99/0757) L24: 65 (RRIV4) Theo Hình 4.6 thì độ đậm hay nhạt của band DNA có thể là do số lượng sợi nấm sử dụng không đều hoặc do chất lượng sợi nấm sau khi nhân sinh khối hoặc do đèn chụp UV không tốt. Tiến hành lấy sản phẩm li trích đem tinh sạch thu được kết quả tinh sạch sản phẩm DNA ly trích là rất tốt (Hình 4.7). Hình 4.7: DNA tổng số đã tinh sạch Ghi chú: L1: 3 (LH9/0023) L6: 14 (LH99/0131) L11: 52 (LH99/0050) L2: 7A (LH99/0081) L7: 23 (LH99/0374) L12: 53 (LH99/0053) L3: 7B (LH99/0081) L8: 28 (LH99/0412) L13: 54 (LH99/0112) L4: 11 (LH99/0093) L9: 35 (LH99/0617) L14: 55 (LH99/0216) L5: 12 (LH99/0098) L10: 42 (LH99/0679) L15: 59 (LH99/0636) L16: 60 (LH99/0675) L17: 62 (LH99/0757) L18: 63 (LH99/0778) L19: 64 (LH99/0672) L20: 65 (RRIV4) Tuy nhiên, trong quá trình tinh sạch có 4 dòng nấm không cho kết quả tốt. Đó là các dòng: 1, 6, 19, 30. Điều này có thể được giải thích là do lượng DNA mẫu sử dụng tinh sạch không tốt hay quá ít. Do đó, khi điện di kết quả tinh sạch không cho kết quả như mong muốn. Chúng tôi đã tiến hành tinh sạch lại nhưng vẫn không thành công. 4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR Hiện nay, để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các dòng nấm phương pháp thông dụng nhất là đánh giá trên vùng gene mã hóa cho các rRNA. Vùng gene này nằm cả trong nhân và ty thể, chúng mã hóa cho hai tiểu đơn vị lớn rRNA và tiểu đơn vị nhỏ rRNA 5,8S. Trong vùng gene này có chứa các vùng bảo tồn và các vùng có khả năng biến dị. Các vùng gene mã hóa cho các tiểu đơn vị có tính bảo tồn cao hơn các vùng gene nằm xen kẽ các trình tự mã hóa đó. Hai vùng thường được sử dụng để nghiên cứu tính đa dạng di truyền là hai vùng có tính biến dị cao đó là vùng ITS (internal transcribed spacers) và vùng IGS (intergenic spacers). Vùng ITS là vùng không có chức năng mã hóa nhưng có khả năng biến dị, nằm giữa các vùng mã hóa có tính bảo tồn cao. Do vậy mà vùng ITS được sử dụng rất nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể. Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng 2 primer là ITS A và ITS B (được thiết kế bởi Silva và cộng sự, 1998) để khuếch đại đoạn DNA nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S và đầu 5’ của rDNA 28S. Hai primer này khuếch đại đặc trưng một đoạn DNA có kích thước 540 bp của vùng ITS nấm. Kết quả đã khuếch đại được đoạn DNA nằm giữa 2 primer. Khi tiến hành PCR theo chu trình nhiệt và hàm lượng primer trong phản ứng của Silva và cộng sự (1998), tôi có thu được đoạn DNA có kích thước 540 bp. Hình 4.8: Sản phẩm PCR theo quy trình cũ của Silva và cộng sự (1998) Tuy nhiên, theo Hình 4.8 thì lượng sản phẩm tạp là tương đối lớn. Sản phẩm tạp này có thể do nhiều nguyên nhân như lượng DNA mẫu cao, nhiệt độ bắt cặp thấp, số lượng chu kỳ nhiều, lượng primer và dNTPs cho một phản ứng quá nhiều… Và tôi đã tiến hành thay đổi một vài yếu tố trong phản ứng PCR và đã thu được sản phẩm rất đặc hiệu, không có tạp (Hình 4.9). Trong các yếu tố của phản ứng PCR được khảo sát thì tôi nhận thấy cần phải tăng nhiệt độ bắt cặp và giảm Tạp Sản phẩmPCR lượng primer trong mỗi phản ứng PCR thì vừa tiết kiệm primer lại vừa giảm được sản phẩm tạp. Hình 4.9: Sản phẩm PCR theo qui trình mới Ghi chú: Điện di ở hiệu điện thế 50 V, nồng độ agarose 1,5%, thời gian 90 phút. L1: 3 (LH9/0023) L6: 14 (LH99/0131) L11: 52 (LH99/0050) L2: 7A (LH99/0081) L7: 23 (LH99/0374) L12: 53 (LH99/0053) L3: 7B (LH99/0081) L8: 28 (LH99/0412) L13: 54 (LH99/0112) L4: 11 (LH99/0093) L9: 35 (LH99/0617) L14: 55 (LH99/0216) L5: 12 (LH99/0098) L10: 42 (LH99/0679) L15: 59 (LH99/0636) L16: 60 (LH99/0675) L18: 63 (LH99/0778) L19: 64 (LH99/0672) L17: 62 (LH99/0757) L20: 65 (RRIV4) L21: Đối chứng âm Sau nhiều lần thay đổi, chúng tôi đã đưa ra một quy trình PCR tương đối ổn định cho việc khuếch đại vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng cặp primer ITS A và ITS B. Thành phần phản ứng PCR sau khi thay đổi được mô tả trong Bảng 4.3. Bảng 4.3: Thành phần phản ứng PCR đã có thay đổi Thành phần Liều lƣợng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối dNTP 0,25 10 mM 0,1 mM 10X PCR buffer 2,5 10 X 1 X MgCl 2 1 25 mM 1 mM ITS A 0,4 25 pM/ l 10 pM ITS B 0,4 25 pM/ l 10 pM Taq polymerase 0,1 5U 0,5U Khuôn mẫu 1 Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l 540bp Chu trình nhiệt có sự thay đổi, gồm 40 chu kỳ: - Chu kỳ 1: Biến tính: 94 o C 3 phút. Biến tính: 94 C 2 phút. Bắt cặp: 57 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút. - 38 chu kỳ tiếp theo: Biến tính: 94 C 1 phút. Bắt cặp: 57 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút. - 1 chu kỳ cuối: Kéo dài: 72 C 9 phút. Giữ ở 4 o C: 10 phút. 4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola Để phân tích sự khác nhau về mặt di truyền có rất nhiều phương pháp như RAPD, RFLP, AFLP…. Trong đó, để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các dòng nấm gây bệnh trên thực vật, người ta thường sử dụng phương pháp RFLP để phân tích. Đối với phương pháp RFLP thông thường phải trải qua một bước quan trọng là Southern blot, vì nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các enzyme cắt giới hạn để phân cắt bộ gene của từng cá thể. Tuy nhiên, nếu sử dụng phương pháp RFLP nguyên bản phải trải qua bước Southern blot rất phứt tạp, do đó để nghiên cứu tính đa dạng di truyền thường sử dụng phương pháp RFLP – PCR. Về cơ bản phương pháp RFLP – PCR không khác nhiều so với phương pháp RFLP thông thường. Nhưng thay vì phải trải qua bước Southern blot thì người ta tiến hành khuếch đại một đoạn DNA trong bộ gene của sinh vật với một cặp primer đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR. Sau đó tiến hành phân cắt sản phẩm PCR thu được bằng các enzyme cắt giới hạn và so sánh giữa các cá thể thông qua số lượng các đoạn DNA xuất hiện trên bản gel điện di. Và khi đó, nếu hai cá thể giống nhau về mặt di truyền thì sau khi cắt sẽ cho ra các đoạn DNA có kích thước giống nhau. Sau khi tiến hành PCR, chúng tôi đã thu được sản phẩm PCR tương đối đặc hiệu và tiến hành phân cắt bằng các enzyme cắt giới hạn. Trong điều kiện cho phép chúng tôi đã sử dụng 7 loại enzyme để phân cắt sản phẩm PCR đó là Hae III, EcoR I, Sau3A I, Alu I, Cfo I, Nde II, Rsa I. Sau khi tiến hành cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chúng tôi tiến hành điện di trên gel 1,5% để kiểm tra kết quả. Đối với enzyme Hae III, sản phẩm PCR của tất cả các dòng được cắt ra làm 2 band với kích thước 2 band là 390bp và 150bp, đồng thời không cho ra band đa hình (Hình 4.10). Hình 4.10: Sản phẩm PCR cắt bằng Hae III Hình 4.11: Sản phẩm PCR cắt bằng EcoR I 300bp 100bp 540bp 540bp 400bp 100bp Theo Hình 4.11. khi cắt sản phẩm PCR bằng enzyme EcoR I sẽ cho ra hai band có kích thước lần lượt là 240 bp và 300 bp. Hình 4.12: Sản phẩm PCR cắt bằng Sau3A I Tương tự với hai enzyme Hae III và EcoR I, enzyme Sau3A I cũng phân cắt sản phẩm PCR thu được thành hai đoạn có kích thước khoảng 340 bp và 200 bp (Hình 4.12). Hình 4.13: Sản phẩm PCR cắt bằng Alu I 540bp 400bp 400bp 100bp 540bp 100bp [...]... http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm&h=201&w= 235 &sz= 3& tbnid=U9tYIYl2DUuMxM:&tbnh=88&tbnw=104&hl=vi&start=1&prev=/images %3Fq%3D%2B%2522ITS%2522%252B%2522fungi%2522%26imgc%3Dmono% 26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D 38 http://www.cirad.fr/presentation/programmes/biotrop/resultats/biositecirad/diversit y/rubbgeo.htm&h=4 7 3& w=6 4 3& sz =35 &tbnid=aCjY42ze2DcHIM:&tbnh=99&tbn w= 135 &hl=vi&start =33 &prev=/images%3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2... Hình 4.1 4: Sản phẩm PCR cắt bằng Cfo I 400bp 400bp Hình 4.1 5: Sản phẩm PCR cắt bằng Rsa I 540bp 400bp 100bp Hình 4.1 6: Sản phẩm PCR cắt bằng Nde II Ghi ch : 1: 3 (LH9/00 23) 6: 14 (LH99/0 131 ) 1 1: 52 (LH99/0050) 2: 7A (LH99/0081) 7: 23 (LH99/ 037 4) 1 2: 53 (LH99/00 53) 3: 7B (LH99/0081) 8: 28 (LH99/0412) 1 3: 54 (LH99/0112) 4: 11 (LH99/00 93) 9: 35 (LH99/0617) 1 4: 55 (LH99/0216) 5: 12 (LH99/0098) 1 0: 42 (LH99/0679)... http://medstat.med.utah.edu/block2/biochem/Formosa/Figures/Lecture6/610%2 0PCR% 20Steps%20Overall.GIF 32 http://origin.sundayobserver.lk/20 03/ 05/04/bus08.html&h=259&w=180&sz =38 &t bnid=BKvmI1A3S8P6fM:&tbnh=107&tbnw=74&hl=vi&start=5&prev=/images% 3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2522origin%2522%26svnum%3D10%26h l%3Dvi%26lr%3D 33 http://plantbio.berkeley.edu/~bruns/) 34 http://www.agronomy.ucdavis.edu 35 http://www.ansinet.org/detail_issue.php?V_No=108&j_id=pjbs# 36 http://www.biology.duke.edu 37 http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm&h=201&w= 235 &sz= 3& . .. Lâm TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 12 Trần Văn Lợt Giáo trình cây công nghiệp Học phần Cây Cao Su Tài liệu học tập, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 2005 70 trang  13 Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005 Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg.) bằng phương pháp RFLP – PCR Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh... 522origin%2522%26start%3D20%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D%26s a%3DN 39 http://www.cirad.fr/presentation/programmes/biotrop/resultats/biositecirad/diversit y/rubbgeo.htm&h=4 7 3& w=6 4 3& sz =35 &tbnid=aCjY42ze2DcHIM:&tbnh=99&tbn w= 135 &hl=vi&start =33 &prev=/images%3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2 522origin%2522%26start%3D20%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D%26s a%3DN 40 http://www.elsevier-deutschland.de/jplhp 41 http://www.hair-loss-stop.com/ref-pathogen -3/ pathogen-research-abs5.2476.html... LH99/0 131 15 29/10 LH99/0217 16 28/80 LH99/0266 17 25/75 LH99/0296 18 28/77 LH99/ 030 9 19 32 /86 LH99/ 033 7 20 26/7 LH99/ 034 7 21 26/11 LH99/ 036 0 22 4/24 LH99/ 036 5 23 1/24 LH99/ 037 4 24 6/92 LH99/ 038 3 25 41/69 LH99/ 039 6 26 15/51 LH99/ 039 6 27 22/84 LH99/0411 28 2/55 LH99/0412 29 2/41 LH99/0 431 30 30 /88 LH99/0 431 31 29/79 LH99/0460 32 7/2 LH99/0489 33 14/1 LH99/05 13 34 19/8 LH99/0581 35 21/55 LH99/0617 36 19/5... của nấm C cassiicola - Tuy có sự khác biệt về màu sắc và hình dạng khuẩn lạc nhưng chúng tôi không tìm thấy sự khác biệt về mặt di truyền khi phân tích bằng kỹ thuật RFLP – PCR - Qua nghiên cứu chúng tôi đã xây dựng được quy trình PCR tương đối chính xác có thể áp dụng để phân tích PCR trên vùng ITS của nấm này - Dựa vào sự khác nhau về ký chủ của nấm này chúng tôi đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền. .. http://www-ang.kfunigraz.ac.at PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các dòng nấm Corynespora cassiicola phân lập từ các mẫu bệnh tại Vƣờn tuyển non Lai Khê - Bến Cát, Bình Dƣơng STT Kí Hiệu DVT đƣợc mã hóa 1 RRIV2 LH82/122 2 7/24 LH99/0019 3 26/20 LH9/00 23 4 39 /19 LH99/0028 5 19/86 LH9/0042 6 29/ 93 LH99/00 53 7 4/48 LH99/0081 8 11/85 LH99/00 83 9 20/85 LH9/0084 10 11/89 LH99/0090 11 28 /37 LH99/00 93 12 19 /38 LH99/0098 13. .. cắt trên sản phẩm PCR thu được Tuy đã phân tích trên một số lượng mẫu tương đối lớn (20 mẫu) và sử dụng 7 loại enzyme để phân cắt nhưng chúng tôi vẫn không tìm thấy bất cứ sự sai khác nào về mặt di truyền của các dòng nấm đã phân tích Các dòng nấm này tuy được phân lập trên nhiều dòng vô tính cây cao su khác nhau nhưng tất cả các dòng vô tính này đều thuộc quần thể Vườn tuyển non của Viện Nghiên Cứu Cây. .. lý, sinh hóa để có thể đánh giá chính xác hơn về tình trạng nhiễm bệnh của cây cao su tại Việt Nam - Nghiên cứu sâu hơn bằng các sử dụng các phương pháp khác như RAPD, AFLP… để đánh giá chính xác mức độ khác biệt di truyền của các dòng nấm C cassiicoal tại Việt Nam - Tiếp tục nghiên cứu trên vùng ITS với các primer khác để có thể chẩn đoán nhanh bệnh do nấm này gây ra bằng kỹ thuật PCR - Xây dựng quy . (LH9/002 3) L 7: 12 (LH99/009 8) L1 2: 30 (LH99/0 43 1) L 3: 6 (LH99/005 3) L 8: 14 (LH99/0 13 1) L1 3: 35 (LH99/061 7) L 4: 7A (LH99/008 1) L 9: 19 (LH99/ 033 7) L1 4: 42 (LH99/067 9) L 5: 7B (LH99/008 1) L1 0: 23 (LH99/ 037 4). (LH99/008 1) 7: 23 (LH99/ 037 4) 1 2: 53 (LH99/005 3) 3: 7B (LH99/008 1) 8: 28 (LH99/041 2) 1 3: 54 (LH99/011 2) 4: 11 (LH99/009 3) 9: 35 (LH99/061 7) 1 4: 55 (LH99/021 6) 5: 12 (LH99/009 8) 1 0: 42 (LH99/067 9). (LH99/008 1) L 7: 23 (LH99/ 037 4) L1 2: 53 (LH99/005 3) L 3: 7B (LH99/008 1) L 8: 28 (LH99/041 2) L1 3: 54 (LH99/011 2) L 4: 11 (LH99/009 3) L 9: 35 (LH99/061 7) L1 4: 55 (LH99/021 6) L 5: 12 (LH99/009 8) L1 0: 42 (LH99/0679)