Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola Wei gây bệnh trên cây cao su tại lai khê bằng phương pháp RFLP-PCR

Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola Wei gây bệnh trên cây cao su tại lai khê bằng phương pháp RFLP-PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

NGÔ QUANG HƯỞNG

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM

Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.)

TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƯƠNG) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM

Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei GÂY BỆNH

TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.)

TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƯƠNG) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

***000***

STUDYING GENETIC DEVERSITY OF Corynespora cassiicola

(Berk & Curt.) Wei POPULATION, DESTRUCTIVE FUNGAL

PATHOGEN OF Hevea brasiliensis Muell Arg

AT LAI KHE (BEN CAT – BINH DUONG), WAS CARRIED OUT BY USING RFLP – PCR

Graduation thesis Major: Biotechnology

MSc PHAN THANH DUNG Term: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006

LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

Thầy PGS.TS Bùi Cách Tuyến - hiệu trưởng trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

ThS Phan Thành Dũng - trưởng Bộ môn bảo vệ thực vật, Viện nghiên cứu cao su Việt Nam

Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường

- Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

- KS Nguyễn Ngọc Mai, KS Vũ Thị Quỳnh Chi cùng tập thể cô chú, anh chị làm việc tại Bộ môn bảo vệ thực vật - Viện nghiên cứu cao su Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận - ThS Nguyễn Văn Cường cùng các anh chị làm việc tại Trung tâm phân tích thí nghiệm hoá sinh - Đại học Nông Lâm TP HCM đã giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt khóa luận

Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 28 - Trường ĐH Nông Lâm TP HCM đã luôn ở bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẽ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận

Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để Con được như ngày hôm nay

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006 Sinh viên Ngô Quang Hưởng

TÓM TẮT

NGÔ QUANG HƯỞNG, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh,

tháng 8/2006 “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis

Muell Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dương) bằng kỹ thuật RFLP – PCR”

Hướng dẫn khoa học: PGS TS Bùi Cách Tuyến

ThS Phan Thành Dũng

Thời gian thực hiện từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006, tại Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương và tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Vấn đề bảo vệ thực vật luôn nhận được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội Đối với một nước sản xuất cao su thiên nhiên như Việt Nam, những nghiên cứu về vi sinh vật, côn trùng, sâu hại trên cây cao su là vô cùng cấp thiết Bệnh rụng

lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra là một bệnh mới và vô

cùng nguy hiểm Nó gây ra những thiệt hại rất lớn về kinh tế Để tạo những tiền đề cho các nghiên cứu về loại bệnh này, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP

– PCR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể nấm C cassiicola tại

Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương

Nôi dung nghiên cứu:

- Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Corynespora cassiicola

- Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS bằng 2 primer ITS A và ITS B

- Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR thu được Các kết quả đạt được:

- Phân lập được 65 dòng nấm và tách đơn bào tử 24 dòng nấm

C cassiicolai trên các dòng vô tính cao su khác nhau

- Dùng PCR khuếch đại được vùng gene nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S và đầu 5’ của rDNA 28S, với kích thước là 540 bp

- Phân cắt sản phẩm PCR với 7 loại enzyme cắt là Hae III, Sau3A I, EcoR I, Nde II, Cfo I, Rsa I, Alu I Kết quả là không tìm thấy băng đa hình khi

cắt bằng 7 loại enzyme trên

Việc sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa dạng di truyền nấm

C cassiicola chưa cho kết quả như mong muốn Không tìm thấy bất cứ sự

khác biệt nào khi phân cắt bằng 7 loại enzyme trên Do đó, cần có những nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự để có những kết luận chính xác về mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm này

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell Arg 3

2.1.1 Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell Arg trên thế giới và tại Việt Nam 3

2.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng mưa, tốc độ gió đến sự phát triển của cây cao su 4

2.1.3 Tình hình bệnh hại trên cây cao su 5

2.2 Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 6

2.2.1 Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt ) Wei 6

2.2.2 Đặc điểm phân loại học của nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 6

2.2.3 Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 7

2.2.4 Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố và triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora 8

2.2.5 Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nước trồng nhiều

cao su trên thế giới 9

2.3 Giới thiệu về phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 10

2.3.1 Sơ lược về kỹ thuật PCR 10

2.3.2 Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR 10

2.4 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP 15

2.4.1 Sơ lược về enzyme cắt giới hạn 15

2.4.1.1 Giới thiệu chung 15

2.4.1.2 Tên gọi các enzyme cắt giới hạn 15

2.4.2.3 Sơ lược về kỹ thuật RFLP – PCR 18

2.6 Giới thiệu về vùng ITS 19

2.7 Một số nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei trong nước và ngoài nước 20

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 22

3.1.1 Thời gian 22

3.1.2 Địa điểm 22

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 22

3.2 Nội dung nghiên cứu 22

3.3.1.4 Phương pháp tách đơn bào tử 23

3.3.1.5 Phương pháp nhân sinh khối 24

3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA của nấm 24

3.3.2.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 24

3.3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA 24

3.3.2.3 Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di 25

3.3.2.3 Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di 27

3.3.3 Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 28

3.3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 28

3.3.3.2 Thực hiện phân tích RFLP 28

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola trên một số dòng vô tính cao su 29 4.1.1 Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây

bệnh rụng lá Corynespora 29

4.1.2 Kết quả phân lập 32

4.1.3 Kết quả tách đơn bào tử 32

4.1.4 Kết quả nhân sinh khối 35

4.2 Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm 36

4.3 Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR 37

4.4 Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola 40

Kb: Kilobase pair

mm: milimét Nu: Nucleotide

PCR: Polymerase Chain Reaction PDA: Potato Dextrose Agar PGA: Potato Glucose Agar PSA: Potato Sucrose Agar R – M: Restriction – Modification

RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid

RE: Restriction Endonuclease

RFLP – PCR: Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism rRNA: ribosome Deoxyribonucleotide acid

TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate

Tm: melting Tempereture

VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Một vài RE và vị trí cắt của nó 16 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng enzyme cắt 28 Bảng 4.1 Tình hình nhiễm bệnh tại một số vườn

trên địa bàn Lai Khê – Bình Dương 30 Bảng 4.2 Các dòng nấm được tách đơn bào tử 33 Bảng 4.3 Thành phần phản ứng PCR đã có thay đổi 39 Bảng 4.4 Kích thước các đoạn DNA sau khi phân cắt bằng các enzyme giới hạn 44

Hình 4.4 Sự khác biệt giữa 2 khuẩn lạc từ 2 đơn bào tử của một dòng nấm 34

Hình 4.5 Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc 35

Hình 4.6 Kết quả li trích 24 dòng nấm khác nhau 36

Hình 4.7 DNA tổng số đã tinh sạch 37

Hình 4.8 Sản phẩm PCR theo quy trình cũ của Silva và cộng sự (1998) 38

Hình 4.9.Sản phẩm PCR theo quy trình mới 39

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Đối với thực vật thì những tác nhân gây thiệt hại về năng suất, chất lượng chủ yếu là sâu hại, virus hoặc nấm gây ra Trên cây cao su cũng vậy, đặc biệt là các loại bệnh do nấm và vi khuẩn Ngay từ khi xuất hiện, bệnh rụng lá do nấm

Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây ra đã gây thiệt hại rất lớn đối

với năng suất và chất lượng của nhiều cây trồng khác nhau (khoảng trên 11 loại cây vùng nhiệt đới) như đậu nành, đu đủ, cao su…Từ đó, ảnh hưởng rất lớn đến nền kinh tế của các quốc gia, đặc biệt là các quốc gia có thu nhập chính từ nông nghiệp, trong đó có Việt Nam

Đối với cây cao su bệnh rụng lá do nấm Corynespora cassiicola gây ra hay

còn gọi là bệnh rụng lá Corynespora (CLFD) đã gây thiệt hại rất nghiêm trọng đối với ngành cao su ở nhiều quốc gia, lãnh thổ trên thế giới Đợt dịch bệnh bùng phát đầu tiên trên cây cao su vào năm 1985 đã gây rất nhiều sự chú ý của các nhà khoa học Cho đến nay, tính chất của bệnh rụng lá Corynespora càng ngày càng nghiêm trọng, quy mô và phổ ký chủ càng ngày càng mở rộng Đồng

thời nấm Corynespora cassiicola có khả năng biến đổi sinh hóa rất lớn Bệnh

này làm rụng lá trên quy mô lớn ảnh hưởng đến năng suất mủ của cây cao su Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên trên cây cao su vào tháng 9/1999 tại các nông trường cao su ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên Nó đã gây ra cho ngành cao su những mối lo mới và ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của ngành cao su Lúc mới xuất hiện, bệnh chỉ xuất hiện trên một số ít dòng vô tính như RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372 Tuy nhiên, ngày càng có nhiều dòng vô tính bị nhiễm bệnh này

Hiện trên thế giới đã có rất nhiều những nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola Tuy nhiên những nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ hình thái cũng như đặc điểm sinh lý của nấm, còn những nghiên cứu về mặt sinh học

phân tử thì rất ít

Để chuẩn bị cho những nghiên cứu sâu hơn về mặt sinh học phân tử của

nấm C cassiicola tại Việt Nam, đồng thời được sự đồng ý của Bộ Môn Công

Nghệ Sinh Học, của thầy PGS.TS Bùi Cách Tuyến, ThS Phan Thành Dũng và đặc biệt là sự giúp đỡ của Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, tôi thực

hiện đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis

Muell Arg) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dương) bằng phương pháp RFLP – PCR”

1.2 Mục đích yêu cầu

- Phân lập thành công các dòng nấm gây bệnh trên các dòng vô tính cây cao su khác nhau

- Đánh giá được sự sai khác về mặt di truyền của một số dòng nấm

Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei phân lập từ các dòng vô tính cao

su khác nhau bằng kỹ thuật RFLP – PCR

1.3 Yêu cầu

- Phân biệt được bệnh do nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei

gây ra trên cây cao su với những bệnh do các nấm khác

- Nắm vững quy trình nuôi cấy, phân lập và tách đơn bào tử nấm

C cassiicola

- Nắm vững quy trình kỹ thuật PCR và kỹ thuật RFLP

PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell Arg

2.1.1 Sơ lƣợc về cây cao su Hevea brasiliensis Mull Arg trên thế giới và tại

Việt Nam

Cây cao su có tên khoa học là Hevea brasiliensis Mull Arg., thuộc họ

Euphorbiaceae (họ thầu dầu) có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 36 Đây là loại cây công nghiệp dài ngày (chu kỳ khai thác là 20 – 30 năm), có giá trị tổng hợp trong tất cả các lĩnh vực nông – lâm – ngư nghiệp Cây cao su có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và lưu vực sông Amazone (Nam Mỹ) Sau đó đến năm 1876, cây cao su được du nhập vào Châu Á và Châu Phi bởi H Wickham Khi Pháp đô hộ nước ta thì ngoài những thay đổi về mặt chính trị thì các nhà tư bản Pháp khi vào Việt Nam cũng đã làm biến đổi cả cơ cấu cây trồng, đặc biệt là các cây công nghiệp Cây cao su cũng là một loại trong số đó, năm 1877 hai cây cao su đầu tiên do một người Pháp tên là Pierre đem về trồng tại Thảo Cầm Viên (Sài Gòn) nhưng sau đó hai cây này đã bị chết

Sau nhiều nỗ lực trong việc đưa cây cao su vào Việt Nam thì cuối cùng vườn cây cao su đầu tiên cũng đã được trồng tại Suối Dầu – Nha Trang do bác sĩ Yersin (Theo Đặng Văn Vinh, 2000) Có được thành công đó phải kể đến nỗ lực của Seeligmann khi ông liên tiếp trong 2 năm 1881 và 1883 đã gửi cây cao su về Sài Gòn trồng

Yếu tố chính trị quyết định rất lớn đến sự phân bố và phát triển của cây cao su trên thế giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng Sau khi người Pháp đã thành công trong việc đưa cây cao su vào trồng tại Việt Nam, thì hàng loạt vườn cao su đã được trồng với mục đích thí nghiệm trong khoảng thời gian 1900 – 1920 Trong khoảng thời gian đầu thế kỷ 20 từ năm 1920 – 1945, cao su được trồng chủ yếu tại Đông Nam Bộ với diện tích là 10.000 ha, chủ yếu trong các đồn điền của người Pháp Đến trước những năm 1945, khi mà các công ty tư bản Pháp khuyến khích người dân trồng cao su làm cho diện tích tăng lên 138.000 ha, với sản lượng bình quân là 77.400 tấn/năm (Hourt Borek, 2003)

Trong giai đoạn 1945 – 1954, đây là giai đoạn cả Việt Nam và Pháp đều tập trung cho cuộc chiến do vậy mà diện tích cây cao su không những không tăng mà còn giảm đáng kể

Trong những năm đầu thập niên 50, cây cao su đã được trồng tại một số vùng Tây Nguyên, miền Trung và một số tỉnh miền Bắc (Đặng Văn Vinh, 2000) Đến năm 1955, diện tích cây cao su đã giảm xuống chỉ còn 24.000 ha với sản lượng 15.000 tấn/năm, chủ yếu do tư nhân quản lý Cuối năm 1960, diện tích cây cao su đã tăng nhanh lên 142.000 ha và sản lượng đạt 76.650 tấn/năm (Hourt Borek, 2003) (trích Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005) Sau đó, diện tích không tăng do cuộc chiến giữa Pháp và Việt Nam bước vào giai đoạn quyết liệt Cuối thời kỳ chiến tranh khoảng những năm 1970 – 1975, thì diện tích cây cao su giảm mạnh chỉ còn 25.000 ha và sản lượng chỉ còn 21.000 tấn/năm Sau giải phóng (năm 1975) theo tài liệu của cục thống kê tháng 5/1975 thì diện tích cây cao su cả nước còn khoảng 75.200 ha Trong đó, Tổng công ty cao su Việt Nam quản lý 55.790 ha, số còn lại do tư nhân và địa phương quản lý Đến năm 1995, trên thế giới có khoảng 9,5 triệu ha, trong đó cao su tiểu điền chiếm từ 75% - 95% (theo Báo cáo nghiên cứu phát triển cây cao su tiểu điền - Tổng công ty cao su Việt Nam từ 28/10/1995 – 1/11/1995, Malaysia – Indonesia – Thái Lan)

Ở Việt Nam, diện tích cao su cả nước khoảng 450.000 ha và sản lượng đạt 400.000 tấn /năm (Tổng công ty cao su Việt Nam, 2004) Trong số này, Tổng công ty cao su quản lý 219.600 ha, trong đó có 173.700 ha đang khai thác mủ Năng suất năm 2003 bình quân đạt 0,52 tấn/ha/năm, trong đó năng suất ở khu vực Đông Nam Bộ là cao nhất với 1,56 tấn/ha/năm

2.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng mưa, tốc độ gió đến sự phát triển cây cao su

Nhiệt độ tốt nhất đối với cây cao su là 25 – 30oC, trên 40oC cây sẽ khô héo, còn dưới 10oC trong thời gian dài cây sẽ héo, rụng lá, rụng chồi… Còn nếu nhiệt độ ở 5oC thì cây sẽ chết

Lượng mưa thay đổi tùy theo tình trạng đất Thông thường lượng mưa thuận lợi nhất là từ 1.500 – 2.000 mm/năm, còn ở những vùng đất không thuận lợi thì lượng mưa cần là 1.800 – 2.000 mm/năm

Tốc độ gió có lợi cho cây cao su là từ 1 – 2 m/giây Nếu tốc độ gió cao từ 8 – 13,8 m/giây sẽ làm lá cây bị rách, bị co lại, phiến lá dày lên nhỏ lại

Nhiệt độ, lượng mưa và tốc độ gió thuận lợi cho sự phát triển cây cao su thì cũng thuận lợi cho sự phát triển của nấm

2.1.3 Tình hình bệnh hại trên cây cao su

Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, rất nhạy cảm với thời tiết Do vậy, cây cao su bị rất nhiều côn trùng và vi sinh vật gây hại Hiện nay, trên cây cao su có rất nhiều bệnh như bệnh về lá, bệnh về thân cành, bệnh rễ (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004) Các bệnh này ảnh hưởng rất lớn đến sản lượng và phẩm chất mủ Đặc biệt là các bệnh về lá như bệnh

phấn trắng do nấm Oidium heveae Steinm gây ra, bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) gây ra, bệnh rụng lá mùa mưa do nấm Phytophthora spp Và nghiêm trọng nhất là bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây ra (Báo cáo tại hội thảo

chuyên đề “Bảo vệ thực vật cây Cao su Việt nam - Hợp tác nghiên cứu và đào tạo giữa Đại học Nông Lâm và Ngành Cao su Việt Nam” – Phan Thành Dũng, 2006) Bệnh rụng lá Corynespora là một bệnh mới, mức độ tàn phá của nó trên cây cao su và nhiều loại cây trồng khác là vô cùng lớn

Ngoài các bệnh do vi sinh vật gây ra, trên cây cao su còn có các bệnh do côn trùng gây ra Các loại côn trùng gây hại cây cao su có thể kể đến như: mối, sâu, sùng hại rễ, nhện, ốc sên, rệp… (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004)

Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài có tầm quan trọng về kinh tế (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004) Theo Nguyễn Hải Đường (1997), có 24 loại bệnh gây hại trên cây cao su ở Việt Nam

2.2 Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei

2.2.1 Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei

Do nấm Corynespora có phổ ký chủ rộng nên đã có rất nhiều nhà khoa học

tìm thấy loại nấm này trên nhiều ký chủ khác nhau Đầu tiên, vào năm 1896 nó Cooke phát hiện nấm này trên cây dưa leo và cây dưa hấu tại Mỹ, đặt tên là

Cercospora melonis Sau đó, Gusgow (1906) đã đặt tên là Corynespora maizei

khi ông tìm thấy chúng trên cây dưa leo tại Đức Đến năm 1948, các nhà khoa học Trung Quốc cho rằng loại nấm họ tìm được trên cây đậu nành, đậu đũa tại Trung Quốc tương tự như những loại nấm gây bệnh trên cùng loại ký chủ ở Mỹ

trước đó và họ đặt tên là Corynespora vignicola Kawamura Liu

Mặc dù có rất nhiều tên gọi khác nhau nhưng cuối cùng Wei cũng đã thu thập, phân tích tất cả những tài liệu về nấm này và khẳng định chúng đều

thuộc một loài là Corynespora cassiicola Và ông đã đặt tên cho chúng là Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei Hiện nay, các kỹ thuật sinh học

phân tử phát triển, càng khẳng định nhận định của Wei là hoàn toàn đúng

Nấm C cassiicola ký sinh trên rất nhiều loài ký chủ khác nhau nhờ khả

năng biến đổi sinh hóa rất nhanh Nhưng mãi đến năm 1949, bệnh mới được phát hiện trên cây cao su đầu tiên ở Sri Lanka Sau đó chúng xuất hiện rất nhiều ở các quốc gia trồng cao su khác như Thái Lan, Indonesia, Braxin…Tuy xuất hiện sớm nhưng đợt dịch bệnh đầu tiên gây nhiều sự chú ý của các nhà khoa học xảy ra vào năm 1985 tại Sri Lanka Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên tại một số nông trường cao su ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên vào năm 1999

2.2.2 Đặc điểm phân loại học của nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei

Nấm C cassiicola có hệ thống phân loại học như sau:

- Ngành: Ascomycota - Lớp: Ascomycetes - Bộ: Pleosporales

- Họ: Corynesporascaceae

- Giống: Corynespora

2.2.3 Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei

Trong môi trường tự nhiên, nấm phát triển trên thực vật bằng cách thức ký sinh hay hoại sinh trên xác bã thực vật Chúng phát triển rất nhanh nhờ phát sinh bào tử Khuẩn ty của nấm có màu sắc biến thiên từ màu xám trắng đến xám đen và nâu Hình dạng bào tử cũng rất đa dạng từ hình lưỡi liềm đến hình que Bào tử có màu nâu nhạt, ở dạng đơn nhưng đôi khi ở dạng chuỗi dính có chứa nhiều vách ngăn chiều dài khoảng 700 m (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004)

Bào tử của nấm được phát tán nhờ gió và mưa Nó được phóng thích vào ban ngày và cao điểm từ 8 – 11 giờ (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004) Trong môi trường tự nhiên, số lượng bào tử phụ thuộc nhiều vào thời tiết, nhiều nhất là sau khoảng thời gian nắng ráo sau những trận

mưa dài Cũng như các nấm khác, bào tử nấm Corynespora có khả năng tồn tại

lâu trong vết bệnh cũng như trong đất mà vẫn giữ được khả năng gây bệnh

Hình 2.1: Hình dạng bào tử nấm C cassiicola

(Nguồn: http://www-ang.kfunigraz.ac.at)

Đây là loại nấm sinh độc tố cassiicoline gây rụng lá rất nhanh Nấm

Corynespora cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới của lá qua lớp biểu bì và

khí khổng

Trái với ngoài tự nhiên, nấm này rất khó sinh bào tử trên môi trường nhân tạo Chúng chỉ sinh bào tử ở những điều kiện rất đặc biệt về nhu cầu ánh sáng,

nhiệt độ hay dinh dưỡng…Trong đó môi trường PDA cải thiện đáng kể khả năng sinh bào tử của nấm Hình dạng và màu sắc khuẩn lạc thay đổi tùy vào điều kiện nuôi cấy, nó phát triển dàn mỏng và rộng trong điều kiện ánh sáng huỳnh quang và thường tụ lại và dày lên khi phát triển trong môi trường tối Nấm phát triển ở nhiệt độ 8 – 36oC, thích hợp nhất ở 28oC và ngưng phát triển ở nhiệt độ trên 40oC (Phan Thành Dũng, 1995)

Các yếu tố phát sinh nguồn bệnh, gồm 3 yếu tố:

- Dòng vô tính cao su mẫn cảm: Tính mẫn cảm của cây cao su đối với

bệnh rụng lá Corynespora tùy thuộc vào từng dòng và tùy thuộc vào điều kiện khí hậu từng nước

- Nấm hình thành loài mới: Nấm C cassiicola là một loài nấm có khả

năng thích nghi với điều kiện môi trường cao Trong những điều kiện khác nhau nấm dễ dàng biến đổi sinh hóa để hình thành nòi mới Ngoài yếu tố môi trường thì yếu tố ký chủ và các dòng vô tính mẫn cảm cũng là các yếu tố giúp phát sinh

Nấm Corynespora cassiicola gây bệnh trên rất nhiều loại ký chủ và trên

phạm vi toàn thế giới Nấm tấn công nhiều loại cây trồng từ các cây rau màu như rau diếp, dưa gang, cà chua hay các cây công nghiệp như đu đủ, cao su, cây

gai…Trong đó, nấm Corynespora cassiicola gây bệnh trên cây cao su mang

tính chuyên biệt cao

Do khả năng thích ứng rất lớn đối với thời tiết mà bệnh do nấm này gây ra đã được ghi nhận ở rất nhiều nước, từ các nước ở vùng ôn đới đến các nước ở vùng nhiệt đới như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Sri Lanka, Việt Nam… Bệnh này tấn công trên cả lá non, chồi và lá trưởng thành, đặc biệt là gân lá Triệu chứng của bệnh cũng biến đổi tùy thuộc vào loại ký chủ và vị trí gây bệnh

- Triệu chứng trên lá: Đầu tiên, xuất hiện các đốm nâu hơi vàng sau đó

vết bệnh lan rộng thành đốm tròn hoặc phân nhánh theo hình xương cá Trên lá trưởng thành, nấm sẽ gây chết từng phần tại các vết bệnh, sau đó lá chuyển sang màu vàng và bị rụng Trên lá non, nấm sẽ làm lá quăn và rụng

- Trên chồi và cuống lá: Chồi xanh dễ bị nhiễm hơn chồi đã hóa nâu

Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ ra và sau đó hóa đen Vết bệnh phát triển dài đến khoảng 20 cm sẽ gây chết chồi, đôi khi chết cả cây Nếu bệnh phát triển trên chồi thì sẽ gây rụng hết lá chét ngay khi còn xanh (Phan Thành Dũng, 2004)

2.2.5 Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nước trồng nhiều cao su trên thế giới

Hiện nay, bệnh rụng lá Corynespora đã xuất hiện và gây thiệt hại ở hầu hết các quốc gia trồng cao su

- Tại Indonesia: Bệnh bùng phát lần đầu tiên vào năm 1980, do đa số

(90%) diện tích trồng cao su là cao su tiểu điền nên những thiệt hại chưa được thống kê một cách đầy đủ Ảnh hưởng rõ nhất là làm tăng thời kỳ kiến thiết cơ bản và làm giảm sản lượng mủ ở vườn khai thác Một số dòng vô tính cây cao su bị nhiễm bệnh từ năm 1980 đến năm 1999 là: RRIC 103 (1980); PNN 2058, 2444, 2447 (1982); GT 1, KRS 21, FX 25, BPM 6, RRIM 725 (1984); RRIM 600 (1991); IAN 837 (1995); AV 2037 (1999) Đối với các dòng bị bệnh thì đa số phải nhổ bỏ và trồng mới

- Tại Malaysia: Dịch bệnh bùng phát vào năm 1985 trên một số dòng vô

tính như RRIC 103, KRS 21, RRIM 725 đã gây thiệt hại nặng về kinh tế Hiện nay, đã có thêm rất nhiều dòng vô tính bị nhiễm bệnh như GT 1, RRIM 600, 701, 702, 703…

- Tại Thái Lan: Đầu tiên bệnh xuất hiện và gây chết đối với dòng vô tính

RRIC 103 và rụng lá nặng trên dòng vô tính KRS 21 Hiện bệnh đã xuất hiện trên toàn bộ diện tích cao su của Thái Lan

- Tại Sri Lanka: Đợt dịch bùng phát vào năm 1985 trên dòng vô tính cao

su RRIC 103 đang được trồng đại trà, do đó đã gây thiệt hại lớn về kinh tế

Hiện nay đã có thêm rất nhiều dòng vô tính bị nhiễm bệnh như RRII 105, RRIM 600, GT 1…

- Tại Việt Nam: Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1999 trên một

số dòng vô tính như LH 88/372, RRIC 103, RRIC 104, do chưa có biện pháp chữa trị và phòng ngừa nên đã tiến hành chặt bỏ và khuyến cáo không trồng các

Năm 1985, Kary Mullis và cộng sự đã phát minh ra kỹ thuật PCR và đến

năm 1988 thì Saiki đã hoàn thiện kỹ thuật này Việc sử dụng enzyme Taq DNA

polymerase trong phản ứng PCR là một bước tiến cực kỳ quan trọng trong các

thí nghiệm sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Kỹ thuật PCR về bản chất là phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự

hiện diện của tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) Phương pháp PCR sẽ khuếch đại đoạn DNA nằm giữa cặp primer Theo nguyên tắc trên thì yêu cầu của phản ứng PCR là phải biết được trình tự đoạn DNA, đặc biệt là trình tự hai đầu của đoạn DNA cần khuếch đại (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.3.2 Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR

2.3.2.1 DNA mẫu

Ưu điểm lớn nhất của phản ứng PCR là có độ nhạy cao Kết quả phản ứng PCR tối ưu khi DNA sử dụng có độ tinh sạch cao Mặc dù vậy phản ứng PCR cũng cho kết quả tốt đối với những mẫu thu trực tiếp mà không qua tinh sạch hay DNA thu được từ những mẫu không được bảo quản tốt, những mẫu đã bị

phân hủy một phần như máu khô hóa thạch, tóc, móng tay người chết… Tuy nhiên, khi mẫu không sạch có lẫn protein sẽ làm cho hiệu quả phản ứng PCR giảm theo (Khuất Hữu Thanh, 2003)

Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm từ 1 g xuống còn 100 ng, khi giảm nồng độ DNA ban đầu sẽ hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) Việc sử dụng nồng độ DNA quá cao sẽ tạo ra những kết quả dương tính giả

2.3.2.2 Primer và nhiệt độ lai

Primer là yếu tố quyết định đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR Một phản ứng PCR chuẩn gồm 2 loại primer: primer xuôi và primer ngược Trong đó, primer xuôi bắt cặp bổ sung trên sợi sen, còn primer ngược bắt cặp trên sợi antisen của phân tử DNA mẫu Việc thiết kế primer đòi hỏi phải đáp ứng được những nhu cầu sau:

- Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược, không có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một primer (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

- Thành phần các nucleotide phải cân bằng Nếu tỉ lệ G, C cao thì số lượng nucleotide của mỗi primer sẽ giảm từ 15- 30 nu xuống còn 18 – 20 nu (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) Tỉ lệ các nu sẽ ảnh hưởng đến nhiệt độ bắt cặp của primer, nhiệt độ này được tính theo công thức:

Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C)

Đồng thời nhiệt độ bắt cặp của hai primer không cách biệt quá xa

- Trình tự được khuếch đại là trình tự DNA nằm giữa hai primer xuôi và ngược, trình tự này không được quá lớn Phải nhỏ hơn 1 Kb đối với phản ứng PCR chuẩn (Khuất Hữu Thanh, 2003) (trích Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005)

- Các primer phải đặc trưng cho trình tự được khuếch đại, không bắt cặp bổ sung với nhiều trình tự trên hệ gene

Trong phản ứng PCR thì nồng độ primer khoảng 1 – 25 pM cho phản ứng 25 – 50 l (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

2.3.2.3 Enzyme

Enzyme được sử dụng lần đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) Tuy nhiên, hiệu quả mang lại không cao do

enzyme này bị bất hoạt ở nhiệt độ cao Việc phát minh và sử dụng enzyme Taq

DNA polymerase trong phản ứng PCR là một bước ngoặc cực kỳ quan trọng trong các thí nghiệm về sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Enzyme Taq polymerase được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus

Đây là vi khuẩn sống ở suối nước nóng, vì vậy chịu được nhiệt độ cao Enzyme

Taq polymerase thu được từ vi khuẩn này cũng chịu đựng được nhiệt độ cao,

đặc điểm này rất phù hợp với điều kiện của phản ứng PCR

2.3.2.4 Mg2+

Là thành phần trong dung dịch đệm, là chất xúc tác của enzyme DNA polymerase Do đó, Mg2+ ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR Nồng độ cao hay thấp của Mg2+

ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của enzyme Taq

polymerase, ảnh hưởng đến quá trình tách mạch đơn của phân tử DNA Nếu nồng độ enzyme thấp sẽ ức chế hoạt động của enzyme, còn nếu nồng độ cao tuy giúp mạch kép của DNA ổn định hơn nhưng lại ức chế sự biến tính hoàn toàn chuỗi DNA Nồng độ Mg2+ ở mức quá cao sẽ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa primer và khuôn Nồng độ tối ưu của Mg2+

cho từng phản ứng phải được xác định qua nhiều phản ứng thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.3.2.5 dNTPs

Nồng độ và thành phần các nucleotide cũng ảnh hưởng đến kết quả PCR Nồng độ dNTPs thường sử dụng là 20 – 200 M Nồng độ dNTPs cao sẽ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh” Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.3.2.6 Số lƣợng chu kỳ

Tuy về mặt lý thuyết thì số lượng chu kỳ là không giới hạn, nhưng trên thực tế thì số lượng chu kỳ thường không vượt quá 40 chu kỳ Khi số lượng chu kỳ quá lớn thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ bị giảm theo số lượng chu kỳ

Nguyên nhân của việc giảm hiệu quả phản ứng PCR là rất nhiều, ví dụ như việc cạn kiệt các thành phần phản ứng, xuất hiện sản phẩm phụ… Do nhiều lý do như vậy, nên việc xác định số lượng chu kỳ phụ thuộc rất nhiều vào số lượng mẫu ban đầu

2.3.2.7 Nhiệt độ và pH

Do liên kết hydro trong phân tử DNA rất nhạy cảm với nhiệt độ nên việc xác định nhiệt độ cho phản ứng PCR là vô cùng quan trọng Với mục đích biến tính DNA thì thường sử dụng nhiệt độ từ 94 – 96oC Còn trong giai đoạn bắt cặp thì nhiệt độ thường được sử dụng là 50 – 56oC, tuy nhiên nhiệt độ này còn tùy thuộc vào đặc tính của primer (tỉ lệ G, C) Nếu tỉ lệ G, C cao thì nhiệt độ bắt cặp cũng sẽ cao theo Ở nhiệt độ 72oC thì enzyme Taq polymerase hoạt động tốt

nhất và hiệu quả kéo dài cao nhất

Trong phân tử DNA, pH ảnh hưởng đến liên kết phosphodiester Khi môi trường có pH = 8 thì DNA sẽ ổn định nhờ sự bền vững của liên kết này Còn nếu pH là acid thì liên kết này sẽ bị phá vỡ Tuy nhiên, pH của phản ứng PCR có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8

2.3.2.8 Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR

Yêu cầu đối với thiết bị phản ứng PCR là rất phức tạp Các thiết bị phải chịu được nhiệt độ, chịu được sự biến thiên liên tục của nhiệt độ và phải tránh được tối đa sự thoát hơi nước của phản ứng PCR

Mọi dụng cụ dùng trong phản ứng PCR phải hoàn toàn sạch để tránh tạp nhiễm Dụng cụ phải chịu được nhiệt độ, chịu được sự biến thiên nhiệt độ cũng như phải truyền nhiệt tốt…

2.3.3 Các bước thực hiện một phản ứng PCR

Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ đều gồm 3 giai đoạn: biến tính, giai đoạn lai, giai đoạn kéo dài

- Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denature)

Trong giai đoạn này thì phản ứng PCR sẽ được đưa lên nhiệt độ 94 – 96oC trong thời gian 30 – 60 giây Ở nhiệt độ này thì phân tử DNA sẽ tách thành hai chuỗi đơn

- Giai đoạn 2: Giai đoạn lai (annealing)

Nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống trong khoảng 40 – 70oC, và nó tùy thuộc vào Tm của primer Ở nhiệt độ này, các primer sẽ bắt cặp với khuôn DNA Thời gian cho sự bắt cặp này từ 30 – 60 giây

- Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (extension)

Thông thường nhiệt độ cho giai đoạn này là 72oC, đây là nhiệt độ hoạt động

tối ưu của enzyme Taq polymerase Enzyme này sẽ giúp kéo dài mạch mới của

phân tử DNA từ primer Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào chiều dài của phân tử DNA Nhưng thường thì thay đổi từ 30 giây đến một vài phút

Trong phản ứng PCR, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn, và các chu kỳ sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần Mỗi lần lặp lại như vậy thì lượng DNA sẽ tăng gấp đôi Như vậy lượng DNA sẽ được khuếch đại theo hàm số mũ:

M = m 2n

Trong đó: M: lượng DNA sau khi khuếch đại m: lượng DNA mẫu ban đầu n: số chu kỳ của phản ứng PCR

2.3.4 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng PCR

Ưu điểm của phản ứng PCR:

- Thời gian thực hiện nhanh, đơn giản, ít tốn kém - Không đòi hỏi mẫu phải tinh sạch cao

Nhược điểm của phản ứng PCR:

- Đòi hỏi phải biết trình tự nucleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, hay chí ít cũng phải biết trình tự hai đầu của phân tử DNA

- Chỉ khuếch đại những phân tử DNA có kích thước nhỏ hơn 3 Kb, tốt nhất là 1 Kb

- Rất dễ bị nhiễm, dẫn đến tạo sản phẩm phụ (dương tính giả)

random priming… Khi kỹ thuật PCR ra đời việc tạo mẫu dò đơn giản hơn nhiều, đồng thời có thể sản xuất một số lượng lớn mẫu dò

- Ứng dụng trong khuếch đại DNA, RNA - Ứng dụng để phân tích đa dạng di truyền - Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh

Kỹ thuật PCR rất nhạy, do đó với một hay nhiều cặp primer ta có thể xác định được sinh vật gây bệnh thông qua các đặc trưng về hệ gene của chúng (Nguyễn Văn Uyển, 1995)

2.4 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction)

2.4.1 Sơ lƣợc về enzyme cắt giới hạn 2.4.1.1 Giới thiệu chung

Enzyme cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA sợi đôi một cách đặc hiệu và lặp lại ở những trình tự xác định (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) Nó đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong phân tích hệ gene, và được xem là một công cụ không thể thiếu để thực hiện kỹ thuật DNA tái tổ hợp

Trong thế giới các loài vi khuẩn, khi vi khuẩn bị thực khuẩn thể xâm nhiễm thì một số dòng vi khuẩn có khả năng tự bảo vệ mình bằng hệ thống R – M Hệ thống này có bản chất là enzyme cắt giới hạn Nó sẽ cắt sợi DNA tại những vị trí rất chuyên biệt trên phân tử DNA ngoại sinh nhưng nó không bao giờ cắt trên bộ gene của nó Do đó các enzyme có đặc tính này có tên là enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) Hệ thống R – M bảo vệ sợi DNA bằng cách làm biến đổi (modification) trong thành phần hóa học của phân tử DNA Phân tử được gắn thêm nhóm methyl vào A hoặc C ở vị trí các enzyme cắt giới hạn Khi vị trí A hoặc C bị methyl hóa, các enzyme cắt giới hạn sẽ không còn nhận biết được vị trí cắt này Do vậy vi khuẩn sẽ tránh bị các enzyme RE cắt chính hệ gene của chúng

2.4.1.2 Tên gọi các enzyme cắt giới hạn

Tên gọi thống nhất cho các enzyme cắt được quy định như sau:

- Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên giống vi khuẩn dùng để ly trích enzyme RE - Hai chữ kế không viết hoa tương ứng với loài của vi khuẩn nói trên

- Tiếp theo là một chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện (trong trường hợp nhiều RE cùng được tìm thấy ở một loài vi khuẩn)

Đôi khi còn sử dụng một chữ viết hoa để chỉ chủng của vi khuẩn sử dụng (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Ví dụ:

Escherichia coli Ry13 và được viết tắt là EcoR

Giống Loài Chủng

Bảng 2.1: Một vài RE và vị trí phân cắt của nó

Trình tự 5’ – 3’

(Nguồn: Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.4.1.3 Các loại RE

Do đặc tính nhận biết và cắt DNA tại những vị trí khác nhau, người ta chia các enzyme cắt giới hạn thành 3 loại:

- Loại 1: Khi enzyme nhận biết trình tự cắt, nó sẽ di chuyển trên phân tử

DNA đến cách đó khoảng 1.000 – 5.000 nu và giải phóng độ vài chục nu

- Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự và cắt luôn tại trình tự đó

- Loại 3: Enzyme nhận biết một trình tự đặc trưng và cắt DNA ở vị trí cách

Các nhà khoa học còn sử dụng RE trong nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn, lập bản đồ giới hạn hay so sánh bộ gene ở các loài khác nhau bằng kỹ thuật RFLP

2.4.2 Sơ lược về phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

2.4.2.1 Giới thiệu chung

RFLP là phương pháp sử dụng một enzyme cắt giới hạn (RE) để cắt một mẫu DNA, sau đó sẽ so sánh số band DNA tạo thành thông qua kỹ thuật điện di để xác định đột biến điểm hay sự khác nhau của các trình tự DNA

Khi trình tự DNA của hai cá thể hoàn toàn khác nhau về kích thước và số lượng thì khi thực hiện cắt bằng cùng một enzyme thì sẽ cho số vạch và kích thước của các vạch khác nhau Do đó, dựa vào kích thước và số lượng band khác nhau, ta có thể xác định có sự khác nhau trong trình tự đoạn DNA nghiên cứu

2.4.2.2 Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP

Một phản ứng RFLP chuẩn bao gồm các bước sau:

- Bước 1: Tách chiết DNA và tinh sạch DNA

- Bước 2: Cắt mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn RE - Bước 3: Điện di và thực hiện phản ứng lai Southern blot

Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng RFLP cần phải thực hiện một phản ứng trung gian là Southern blot (Hình 2.2) Do đó kỹ thuật này rất tốn kém và phức tạp

Quy trình thực hiện:

- Tách chiết DNA

- Thực hiện PCR khuếch đại trình tự đích bằng một cặp primer thích hợp - Xử lý sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn

- Điện di và nhuộm ethidium bromide để kiểm tra kết quả

Ngoài các ưu điểm trên, so với phương pháp RFLP thông thường thì phương pháp RFLP – PCR còn có nhiều ưu điểm như: cần lượng DNA mẫu ít, đọc kết quả điện di trực tiếp bằng mắt không dùng đồng vị phóng xạ mà chỉ sử dụng ánh sáng huỳnh quang để đọc kết quả

2.5 Giới thiệu về vùng ITS

Vùng ITS là vùng nằm xen kẽ với các trình tự rDNA (Hình 2.3) Các trình tự rDNA mã hóa cho các rRNA, các rRNA sẽ kết hợp với protein để tạo ra ribosome có chức năng tổng hợp protein Trong các vùng này thì vùng rDNA là vùng bảo tồn nhất, kế đến là vùng ITS còn vùng biến động nhất là vùng IGS

Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS của nấm

(Nguồn: http://plantbio.berkeley.edu/~bruns/) Đặc điểm của vùng ITS (Bridge và cộng sự, 2000):

- Đây là vùng có kích thước ngắn (khoảng 500 – 800 bp), dễ dàng khuếch đại bằng phản ứng PCR

- Vùng ITS có tính bất ổn hơn vùng gene mã hóa rDNA

- PCR có thể khuếch đại vùng này bằng các primer đặc trưng Các nhà nghiên cứu đã lựa chọn vùng ITS để tìm những vùng gene đặc trưng cho loài, từ đó giúp xác định loài nhanh chóng

Do tính chất như vậy mà vùng ITS đã được sử dụng nghiên cứu với mục đích là tìm ra và xác định sự đa dạng di truyền của nhiều loài nấm (Carbone và Kohn, 1993; Hallenberg và cộng sự, 1996; Hirata và Takamatsu, 1996) Năm

1996, Edel và cộng sự tiến hành phân tích RFLP trên vùng ITS và đã tìm ra một

vài sự khác biệt trên nấm Fusarium oxysporum

Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều kỹ thuật như PCR, RFLP, DNA sequencing để nghiên cứu vùng ITS (Kuninaga và cộng sự, 1997) Đối với các loài nấm, vùng ITS có tính bảo tồn khá cao đối với các dòng nấm có quan hệ di truyền gần gũi nhau Ngoài việc sử dụng vùng ITS để phân tích cây phát sinh loài, nó còn được sử dụng với mục đích phát hiện và định danh vi sinh vật (Vandepeer và cộng sự, 1996) Tuy nhiên, thông thường người ta sử dụng vùng ITS để xác định sự biệt hóa trong cùng loài (Guarro, 1999) Nazar và cộng sự (1991) đã sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS để phát hiện và định danh nấm

Verticillium albo-atrum và V dabliae Trong một nghiên cứu tương tự trên dòng Verticillium tricorpus, Moukhamedov và cộng sự (1993) đã định danh được chúng thuộc loài Verticillium Trước đây, người ta phân loại chủ yếu dựa

trên những đặc điểm về hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả thường có độ tin cậy không cao Với việc phát triển các kỹ thuật nghiên cứu sinh học phân tử trên vùng ITS, người ta có thể phân loại các dòng nấm một cách rất chính xác Năm 1996, Boysen và cộng sự

đã sử dụng PCR trên vùng ITS1, ITS2 của nấm Rhizoctonia solani để phân tích

đặc tính bệnh và xác định được 3 nhóm phụ

Với các ưu điểm như vậy, vùng ITS càng ngày càng được nghiên cứu rộng rãi và phổ biến hơn Nó là vùng đạt được kết quả nhiều nhất trong nghiên cứu sinh học phân tử của nấm

2.6 Một số nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.)

Wei trong nước và ngoài nước

Đã có rất nhiều những nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola Tuy

nhiên, do là loại nấm mới bùng phát nên đa số các nghiên cứu đều là nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh, khả năng sinh độc tố cassiicoline và sự phân bố của chúng trên nhiều lãnh thổ khác nhau Những nghiên cứu này đã làm thay đổi cách đánh giá về khả năng gây bệnh của loài nấm này Kết quả của

những nghiên cứu cho thấy nấm Corynespora cassiicola có phổ ký chủ rất

rộng, đồng thời khả năng sinh độc tố cũng thay đổi rất lớn tùy thuộc vào các dòng vô tính cao su được ghi nhận (Jayashinge và cộng sự, 1998)

Hiện nay, ở Việt Nam những nghiên cứu về nấm C cassiicola là chưa

nhiều Ngoài những nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh còn có các nghiên cứu về khả năng kháng bệnh này của một số dòng vô tính cao su Vũ

Thị Quỳnh Chi (2005) đã sử dụng các enzyme EcoR I, Msp I, Cfo I, Hae III, Sau 3A, Rsa I để phân tích đa dạng di truyền trên 7 dòng nấm C cassiicola

(RRIV 2, RRIV4, AC 88, RO/CM/10, MT/C/5, LH 82/008, LH 83/152), kết quả không tìm thấy sự đa hình nào khi cắt bằng các enzyme giới hạn trên

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về loại nấm này Đa số các nghiên cứu đều tập trung vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh… của chúng Kết quả các nghiên cứu này đã chứng minh đây là một loài nấm nguy hiểm, có khả năng bùng phát trên diện rộng Ngoài khả năng sinh độc tố, nấm này còn có khả năng tổng hợp enzyme phân hủy peptin và cellulose (C.K Jayashinge, 2000)

Năm 1995, Silva và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD – PCR để phân tích

sự khác biệt về mặt di truyền của 42 dòng nấm C cassiicola khác nhau và đã

phân thành 5 chủng nấm khác nhau và đã xếp chúng vào 3 nhóm di truyền Ngoài kỹ thuật RAPD, kỹ thuật RFLP – PCR cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa hình của các dòng nấm Năm 2003, Safiah Atan và Noor Hisham Hamid đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP – PCR để phân tích sự khác biệt về mặt di truyền của 9 dòng nấm Kết quả là đã xếp chúng vào 2 chủng khi nghiên cứu bằng RAPD Kết quả phân tích với kỹ thuật RFLP – PCR cho thấy không có sự sai khác đáng kể nào trong 9 dòng nấm được nghiên cứu

Năm 1998, Silva và cộng sự đã dùng kỹ thuật RAPD và phân tích RFLP trên vùng ITS của 32 dòng nấm Ông không tìm thấy sự đa hình nào khi nghiên cứu bằng kỹ thuật RFLP –PCR, còn với kỹ thuật RAPD đã phân 32 dòng nấm này thành 7 nhóm di truyền