Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizotonia solani gây bệnh khô vẳn lúa

Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizotonia solani gây bệnh khô vẳn lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI

TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Rhizotonia solani GÂY BỆNH

KHÔ VẲN LÚA

Nghành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003-2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ MINH THƯ

Thành phố Hồ Chí Minh

-2007-

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI

TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH

KHÔ VẰN LÚA

GVHD: Sinh viên thực hiện:

Thành phố Hồ Chí Minh 8 - 2007

 Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy - Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường ThS Từ Thị Mỹ Thuận đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa

luận

Các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hướng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận

Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp

Thành Phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 8 năm 2007 Nguyễn Thị Minh Thư

iv

TÓM TẮT

Nguyễn Thị Minh Thư, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 “Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm

Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa”

Bệnh khô vằn lúa gây ra bởi nấm R solani được xem là bệnh gây ra nhiều

thiệt hại rất nghiêm trọng trên lúa Sự đa dạng di truyền cùng với phổ kí chủ rộng của nấm gây khó khăn cho việc lựa chọn các dòng kháng cũng như việc xây dựng các biện pháp phòng và trị nấm một cách hiệu quả và an toàn cho môi trường Khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm là một bước cần thiết nhằm hiểu rõ hơn về di truyền của quần thể nấm và cung cấp thêm thông tin cho việc xây dựng phương pháp phòng và trị nấm

17 dòng phân lập nấm R solani thu thập từ nhiều tỉnh khác nhau được li

trích DNA và thực hiện phản ứng RAPD với 3 primer OPL-05, OPL-08, OPM-13 Phân tích dữ liệu phản ứng RAPD bằng phần mềm NTYSYSpc đã chia 17 dòng nấm thành 2 dòng lớn Sơ đồ phân nhóm có tỷ lệ tương đồng di truyền khoảng 53

– 89 % và cho thấy sự đa dạng di truyền của 17 dòng phân lập nấm R solani

Thông tin của nghiên cứu này có thể dùng để tăng thêm sự hiểu biết về di truyền

của các dòng nấm R solani và làm cơ sở để xây dựng phương pháp phòng và trị

nấm một cách hiệu quả và an toàn cho môi trường

v

SUMMARY

Nguyen Thi Minh Thu, Nong Lam university, Ho Chi Minh city, 8/2007 “Use

RAPD analysis study genetic diversity of Rhizoctonia solani population

pathogenic sheath blight in rice”

Sheath blight caused by R solani is an important disease on rice This disease

is cause of serious damage in rice crop Chosing assistant plant culture and building strategy against this fungi is very difficult because of genetic diversity of

R solani isolates So, study genetic diversity is the fisrt step to know about this

fungi

Therefore, 17 R solani isolates were recognized from several diffirent provinces were extracted total DNA and realize RAPD reaction with three primer OPL-05, OPL-08, OPM-13 Analysis RAPD data by NTSYSpc software was divided 17 isolates place into two group Rate genetic similarity of these analysis isolate was a range from 53 to 89% Information of study could enhance

knowledge about genetic of R solani isolates and to basis to build a method

against fungi effect and safe for environment

vi

MỤC LỤC

Trang bìa Trang tựa

1.2.2 Yêu cầu đề tài 2

1.3.Giới hạn của đề tài 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani 3

2.1.1.Đặc điểm hình thái 3

2.1.2 Đặc điểm sinh lý 4

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 5

2.1.4 Phạm vi kí chủ của nấm Rhizoctonia solani 5

2.1.5 Sự phân nhóm của nấm Rhizoctonia solani 6

2.2 Bệnh khô vằn hại lúa do nấm Rhizoctonia solani gây ra 6

2.2.1 Triệu chứng bệnh 7

2.2.2 Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh 7

vii

2.3 Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền 9

2.3.1 Phương pháp RFLP (Retriction Fragment Length Polymorphism) 9

2.3.2 Phương pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism) 10

2.3.3 Microsatellite 11

2.3.4 Phương pháp RAPD (Random Amplification Polymorphism DNA) 11

2.3.4.1 Giới thiệu kỹ thuật RAPD 11

2.3.4.2 Một số vấn đề thường gặp khi thực hiện phản ứng RAPD 12

2.3.4.3 Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD 13

2.3.4.4 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD 13

2.3.4.5 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 13

2.3.4.6 Những cải tiến của kỹ thuật RAPD 14

2.4 Các kết quả nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani 14

2.4.1 Những nghiên cứu trong nước 14

2.4.2 Những nghiên cứu ở nước ngoài 15

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3.1 Thời gian và địa điểm 16

3.2 Vật liệu nghiên cứu 16

3.2.1 Nguồn nấm 16

3.2.2 Những hoá chất được sử dụng trong nghiên cứu 16

3.2.2.1 Những hóa chất sử dụng để li trích DNA 16

3.2.2.2 Những hoá chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD 16

3.2.2.3 Những hoá chất sử dụng để điện di sản phẩm RAPD 18

3.2.3 Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 18

3.2.3.1 Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong li trích 18

3.2.3.2 Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong phản ứng RAPD 18

3.2.3.2 Các dụng cụ và thiết bị dùng trong điện di 18

3.3 Phương pháp tiến hành 19

3.3.1 Ly trích DNA tổng số của nấm R solani 19

viii

3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát số lượng chu kì phản ứng 20

3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD 21

3.3.3 Thực hiện phản ứng RAPD 23

3.3.4 Điện di sản phẩm RAPD 23

3.3.5 Phân tích kết quả RAPD 23

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Kết quả li trích DNA tổng số của nấm R solani 24

4.2 Tối ưu hoá phản ứng RAPD 25

4.2.1 Lượng DNA mẫu 25

4.2.2 Khảo sát chu kì phản ứng 26

4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD 26

4.3 Phản ứng RAPD của các dòng phân lập nấm R solani 29

4.4 Đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R solani 32

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified fragment length polymorphism

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG Hình 2.1 Bệnh khô vằn trên cây lúa 6

Hình 4.1 Ảnh điện di DNA tổng số của các dòng phân lập nấm R solani 24 Hình 4.2 Ảnh điện di DNA của các dòng phân lập nấm R solani sau khi pha

loãng 25 Hình 4.3.Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L651 với primer OPM-08 ở các số chu kì khác nhau của qui trình nhiệt 26 Hình 4.4.Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với các nồng độ MgCl2 và primer khác nhau 27 Hình 4.5 Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với các nồng độ DNA mẫu và Taq khác nhau 28

Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với

Hình 4.9 Sơ đồ phân nhóm (dendrogram) của 17 dòng phân lập nấm R solani dựa

trên sản phẩm RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05, OPl-08 32

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 3.1.Kí hiệu và địa điểm thu thập 17 dòng phân lập nấm R.solani được dùng

trong nghiên cứu 17

Bảng 3.2 Tên và trình tự các primer dùng trong nghiên cứu 17

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD 20

Bảng 3.4 Thành phần hoá chất được sử dụng trong phản ứng RAPD 20

Bảng 3.5 Bảng thành phần hoá chất dùng trong thí nghiệm 1 21

Bảng 3.6 Bảng thành phần hoá chất dùng trong thí nghiệm 2 22

Bảng 4.1 Thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD được sử dụng để khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm R solani 29

Bảng 4.2 Ma trận tỷ lệ tương đồng di truyền (%) giữa 17 dòng phân lập nấm R solani dựa trên sản phẩm RAPD với 3 primer OPL-05, OPL-08, OPM-13 33

Bảng 7.1 Số liệu mã hoá của sản phẩm phản ứng RAPD trước khi xử lí bằng phần mềm NTSYS 41

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề

và cũng là nguyên nhân gây ra bệnh khô vằn lúa Hiện nay, nấm R solani đang gây

bệnh khô vằn lúa trên khắp lãnh thổ Việt Nam gây ra nhiều thiệt hại nghiêm trọng Nấm R solani không chỉ gây bệnh trên cây lúa mà còn gây nhiều bệnh trên

các cây trồng khác như đậu xanh, đậu nành, mía, khoai tây, lúa miến và trên một số

loài cây ăn quả Không những thế, R solani còn kí sinh được trên cả các loài cỏ như

cỏ chỉ, cỏ ống, cỏ linh lăng, cỏ lồng vực…

Phòng trừ bệnh này bằng biện pháp luân canh hiện nay không có hiệu quả

do phổ kí chủ quá rộng của nấm R solani Bên cạnh đó, sự đa dạng di truyền của

nấm gây khó khăn cho việc sàng lọc các giống kháng Việc phòng trừ nấm bằng hoá chất thì cho hiệu quả khá cao, tuy nhiên, phương pháp này lại gây hại cho môi trường đồng thời cũng ảnh hưởng xấu đến tính an toàn của sản phẩm lúa gạo

Để có thể kiểm soát bệnh khô vằn lúa do R solani gây ra thì cần phải hiểu về cấu trúc quần thể của các dòng phân lập nấm R solani Bước đầu tiên để có thể hiểu được cấu trúc quần thể là cần phải hiểu về sự đa dạng di truyền của R solani

bởi sự đa dạng di truyền phản ánh lịch sử tiến hoá và tiềm năng tiến hoá của quần thể

Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử hiện nay, nhiều phương pháp đã được sử dụng để nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của các loài nấm bệnh

nói chung và R solani nói riêng như RFLP, RAPD, AFLP…….Trong những kỹ

thuật được sử dụng, RAPD được xem là kỹ thuật có nhiều ưu điểm do rẻ tiền, nhanh, nhạy, cần lượng mẫu ít và không cần biết trình tự DNA của loài cần nghiên cứu Do những ưu điểm đó nên RAPD đã được chọn để thực hiện đề tài này

Với mong muốn được hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của các dòng

phân lập nấm R solani gây bệnh trên lúa, nhằm cung cấp thêm thông tin để xây

dựng biện pháp quản lí nấm một cách hữu hiệu, chúng tôi thực hiện đề tài : “ Sử

dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu

Khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa, cung cấp thông tin để tăng thêm sự hiểu biết về di truyền của nấm R solani và làm cơ sở cho việc xây dựng các biện pháp phòng trừ nấm hiệu quả và an

toàn cho môi trường

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

Li trích DNA của các dòng phân lập nấm R solani

Tối ưu hoá qui trình nhiệt và thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD Dùng phương pháp RAPD để khảo sát sự đa dạng di truyền của dòng nấm

R solani

1.3 Giới hạn của đề tài

Đề tài chỉ được thực hiện với 3 primer ngẫu nhiên và 17 dòng nấm phân

lập (isolate) R solani

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani

Nấm Rhizoctonia solani là một nhóm nấm lớn rất đa dạng và phức tạp Giai đoạn vô tính, R solani thuộc bộ nấm trơ Mycelia steliria, lớp nấm bất toàn

Fungi imperfecti (theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998) Giai đoạn hữu tính

nấm có tên là Thanatephorus cucumeris, thuộc họ Ceratobasidiaceae, bộ

Ceratobasidiales, ngành Basidiomycota

R solani thường tồn lưu dưới dạng sợi nấm và hạch nấm trên tàn dư thực

vật và trên đồng ruộng Bào tử hữu tính hiếm khi gặp trên cây bệnh

Trước đây, Pellicularia filamentosa và Corticium solani là tên được sử

dụng cho loài nấm này

2.1.1 Đặc điểm hình thái

Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch Sợi nấm khi còn non không màu, khi già chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu Sợi nấm đa bào, có đường kính từ 8 - 13µm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chỗ phân nhánh hơi thắt lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê

Lương Tề, 1998) R solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm

phân nhánh (lobate hyphae) và các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005)

Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch Đặc điểm của hạch rất hay thay đổi Hạch nấm khi còn non có màu trắng nhưng khi về già có thể có màu nâu, nâu đen, nâu xám và trên vỏ có lông Hạch nấm có hình dạng phức tạp, đôi khi hình cầu, đáy phẳng, bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đường Hồng Dật, 1976) Đường kính hạch nấm từ 1- 6 mm Từng hạch nấm có thể liên kết lại với nhau tạo thành hạch nấm to (Ou, 1983) Hạch nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi già nổi lên do tế bào phía ngoài hạch trở nên rỗng (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005)

Sợi nấm của R solani có nhiều nhân ( thông thường từ 4 đến 8 nhân) trong một tế bào Điều này khác biệt với các nấm Rhizoctonia khác có đặc tính của sợi nấm tương tự Rhizoctonia solani, nhưng chỉ với 2 nhân trong tế bào và được gọi là binucleate Rhizoctonia

Sự sinh sản hữu tính của nấm tạo ra bào tử đảm Thông thường có khoảng 4 bào tử đảm đơn bào được tạo thành khi môi trường trở nên ấm ướt và thuận lợi cho sự phát triển của nấm Bào tử đảm phân tán theo gío và nảy mầm khi gặp môi trường ẩm ướt Mỗi bào tử đảm có 1 nhân đơn và có hình trứng hoặc hình bầu dục

Thông thường không tìm thấy sự xuất hiện của bào tử đảm trên những mẫu cây bệnh Nhiều phương pháp đã được phát triển nhằm tạo bào tử đảm trên mô kí chủ nhưng nó hình thành rất khó khăn (theo Uchida, 1995)

2.1.2 Đặc điểm sinh lý

Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 28 – 32oC, ở nhiệt độ dưới 10oC và cao hơn 38oC nấm ngừng sinh trưởng Hạch nấm hình thành nhiều ở nhiệt độ 30 – 32oC Khi nhiệt độ quá thấp (12oC) và quá cao (40oC), nấm không hình thành hạch Nấm có thể phát triển được trong phạm vi pH rộng từ 3,4 - 9,2, thích hợp nhất ở độ pH 6 - 7

Hạch nấm hình thành nhiều nhất ở ngoài ánh sáng và khi nhiệt độ môi trường giảm đột ngột Các hạch nấm này nảy mầm ở nhiệt độ 16 – 30oC, nhiệt độ tối ưu 28 – 30oC Ẩm độ tương đối 95 - 96% thích hợp cho hạch nấm nảy nầm (Ou, 1983) Hạch nấm có kích thước càng lớn, số lượng hạch càng nhiều thì độc tính càng cao Hạch nấm có thể sống được 4 - 5 tháng trong đất khô, 7 tháng trong điều kiện ngập nước (Đường Hồng Dật, 1976)

R solani có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng (20 - 300C) từ 6 - 12 tháng trong ống nghiệm chứa môi trường PDA (potato dextrose agar), PDYA (potato dextrose yeast extract agar) hoặc các vật liệu cây trồng tự nhiên Nấm có thể tồn trữ trên môi trường hạt đậu khô đến 9 năm mà không làm mất tính độc Tính độc của chúng bị mất trong vòng 2 - 3 tháng khi tồn trữ ở nhiệt độ từ 0 - 70C (Carling và Sumner, 1992)

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy

Nấm R solani không đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng chuyên biệt, nó có thể

phát triển tốt trên nhiều loại môi trường khác nhau Hạch nấm thường hình thành sau 3-4 ngày nuôi cấy Hạch nấm hình thành nhiều hay ít, có hình thành hay không phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, điều kiện ngoại cảnh cũng như phụ thuộc vào các nhóm nấm khác nhau Hạch nấm thường mọc rải rác khắp đĩa, có loài mọc rời, cũng có loài mọc thành từng mảng liên kết với nhau Tuy nhiên cũng có loài không hình thành hạch (Nguyễn Minh Nguyệt, 2003) Hạch nấm mọc trên môi trường nuôi cấy có kích thước lớn hơn so với hạch nấm mọc trên cây kí chủ tự nhiên (Ou,

1983) Nhìn chung, tốc độ phát triển của R solani rất nhanh, tản nấm của chúng có

thể phát triển trên toàn bộ đĩa petri 90 mm trong vòng 3 ngày

2.1.4 Phạm vi ký chủ của nấm R solani

Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm R solani là loại nấm bán

ký sinh, có tính chuyên hóa rộng, phạm vi ký chủ bao gồm trên 180 loài cây trồng khác nhau.

Quốc gia nào cũng có bệnh do nấm này gây ra Ngoài cây lúa, nấm còn

gây bệnh trên lúa miến, bắp, mía, đậu nành, đậu xanh Nấm R solani còn gây bệnh

lở cổ rễ trên cà phê, trà, héo rũ dưa chuột và bầu bí, gây lở cổ rễ hại bông, héo vàng trên khoai tây (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001)

Haque (1975) đã phát hiện ra đậu phộng, ớt, cà rốt, đậu nành, bông vải, đại

mạch, xà lách, lúa, bắp, cà chua, đều nhiễm R solani (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến

Sỹ, 2005)

Ở Việt Nam, đậu nành, bắp, lúa miến, mía và 27 loài cỏ dại khác ở đồng

bằng sông Cửu Long đều là ký chủ của nấm R solani Trong khi đó ở Mỹ, có khoảng 550 loài ký chủ của nấm R solani đã được ghi nhận (dẫn theo Nguyễn Việt

Long, 2001)

2.1.5 Sự phân nhóm của nấm R solani

R solani là loài nấm phức tạp, không đồng nhất Nhiều nghiên cứu cho

thấy có sự khác biệt giữa các dòng phân lập của nấm này về mặt hình thái học, sinh

lý học và khả năng gây bệnh cho các loại cây trồng Có hai kiểu phân loại R solani:

(i) Phân loại dựa trên sự khác nhau về tốc độ tăng trưởng, sự hình thành hạch nấm và đặc điểm phát triển khuẩn lạc Theo cách phân loại này, Watanabe và

Matsuda (1966) đã xếp các dòng phân lập của nấm R.solani thành 6 nhóm: 1A, 1B,

II, IIIA, IIIB,và IIIC (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2003)

(ii) Phân loại dựa trên sự tiếp hợp (Anastomosis) của sợi nấm Chúng được sắp xếp vào các nhóm AG (Anastomosis Group) khác nhau trên cơ sở phản ứng tiếp hợp của chúng Xác định AG của các dòng phân lập giúp cho việc nhận

biết và phân nhóm các dòng nấm R solani được thực hiện dễ dàng (Carling và ctv,

1992)

Dựa vào sự tiếp hợp của sợi nấm, các dòng phân lập của R solani được

phân chia làm 11 nhóm tiếp hợp từ AG-1 đến AG-11 và AG-BI (Carling và

Sumner, 1992)

2.2 Bệnh khô vằn hại lúa do nấm R.solani gây ra

Hình 2.1 Bệnh khô vằn trên lúa (nguồn: www.mard.gov.vn)

Bệnh khô vằn hại lúa được phát hiện khá sớm ở Nhật Bản từ những năm 1910 và một số nước khác trên thế giới Phạm vi phân bố của bệnh khá rộng trên tất cả các nước trồng lúa ở Châu Á và các nước Brazil, Venezuela, USA ….( theo Ou, 1983)

Tại Việt Nam, bệnh khô vằn hại lúa phát triển hầu như trên toàn lãnh thổ và gây ra nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho nông dân Khi nấm phát triển lên đến lá đòng của cây lúa, thiệt hại sẽ là 25% Nhưng nếu nấm phát triển lên đến bông lúa thì thiệt hại năng suất lên đến 40 – 100%

2.2.1 Triệu chứng bệnh

Theo Ou, 1983, đầu tiên, vết bệnh có màu xám- xanh nhạt, hơi ướt, dài khoảng 10 mm Sau đó các vết bệnh lớn lên và có thể dài đến 2-3cm Trung tâm các vết bệnh trở thành màu trắng- xám nhạt Hạch nấm được hình thành xung quanh hoặc trên vết bệnh nhưng chúng rơi rụng dễ dàng

Các vết bệnh phát triển ngày càng nhiều và liên kết lại với nhau thành từng đám chồng chất lại với nhau với nhiều màu sắc khác nhau nên trông vằn vện như da cọp hoặc các vân mây Phần trên vết bệnh mọc những sợi nấm màu trắng, có thể mọc ở phần thân trên mặt nước lên trên cổ bông, sau đó xuất hiện nhiều khuẩn hạch còn non có màu trắng về già có màu nâu vàng kích thước hạch lớn thường có hình dẹt hoặc hình như trái đậu phộng.( Nguồn: www.mard.gov.vn)

Trên đồng ruộng, các vết bệnh đầu tiên thường xuất hiện trên những lá lúa ở gần mặt nước Khi điều kiện thích hợp cho sự phát triển bệnh, các vết bệnh sẽ phát triển trên cả bẹ lá và phiến lá, điều này thường làm lá chết Trong trường hợp bệnh nghiêm trọng, tất cả các lá trên cây lúa sẽ bị chết Ở các vùng nhiệt đới, bệnh đốm vằn thường làm cho hầu hết các lá trên cây lúa đều bị chết (theo Ou, 1983)

2.2.2 Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh

Mầm bệnh tồn lưu trên đồng ruộng từ những cây lúa bị bệnh trong mùa trước Hạch của nấm nổi trên mặt ruộng trong quá trình làm đất Nó có thể trôi giạt theo nước và tiếp xúc với cây lúa, thông qua đó gây bệnh cho cây lúa

Nấm xâm nhập vào mô cây qua khí khổng hoặc có thể xuyên trực tiếp qua cutin (Ou, 1983) Thông thường, nấm xâm nhập vào từ mặt trong của lá nhưng đôi khi nấm cũng xâm nhập từ cả 2 mặt của phiến lá Nấm có khả năng gây bệnh trong phạm vi nhiệt độ 23 - 350C, nhiệt độ tối thích là 300C- 320C, ẩm độ tương đối 96 - 97% (theo Ou, 1983) Ngoài ra, khi đồng ruộng có lượng đạm quá cao sẽ kích thích

bệnh phát triển và lượng Kali quá thấp sẽ làm cho bệnh nặng thêm Các cây lúa có tán rộng, bẹ dày sẽ ít nhiễm bệnh hơn so với các cây lúa thấp và có bẹ ngắn

Ngay sau khi các vết bệnh đầu tiên đã hình thành, sợi nấm mọc nhanh chóng trong cây lúa và các mô của chúng Các vết bệnh sẽ phát triển ra 2 bên và lan rộng lên bên trên, sau đó, vết bệnh thứ 2 sẽ hình thành Khi các vết bệnh còn non, các sợi nấm phát triển rất tích cực nhưng đối với các vết bệnh đã bạc màu thì sợi nấm phát triển rất chậm

Bệnh có thể phát triển theo chiều ngang ( lây nhiễm sang cây bên cạnh) hoặc chiều đứng (bệnh phát triển từ gốc lên lá bông lúa) Bệnh phát triển càng cao thì năng suất sẽ càng giảm Sự lây nhiễm chiều ngang của bệnh phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ, ẩm độ, mật độ sạ, cấy lúa… Ngược lại, sự phát triển dọc của bệnh phụ thuộc nhiều vào cây lúa như giống kháng, lượng N, K trong thân cây (Nguồn: www.mard.gov.vn)

2.2.3 Phòng và chống bệnh khô vằn lúa

Hiện nay vẫn chưa có được những phương pháp trừ nấm hoàn toàn hiệu quả và an toàn cho môi trường Tuy nhiên, có thể dùng nhiều biện pháp để phòng bệnh như:

Làm sạch cỏ

Cày bừa, lật đất để vùi hạch nấm Đốt rơm rạ sau khi thu hoạch Sạ cấy với mật độ thích hợp

Bón cân đối N - P - K, không nên bón N nhiều và bón thúc muộn Ngoài ra, ta có thể dùng các thuốc hoá học như: validacin, anvil, rovral,

monceren, topsin-m, carbenzim… để trừ bệnh Các loại nấm đối kháng với R solani như Trichoderma spp cũng là một trong những sự lựa chọn tốt (Nguồn:

www.mard.gov.vn)

2.3 Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền 2.3.1 Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Trong phân tích genome, restriction endonuclease là nhóm enzyme có nhiệm vụ cực kỳ quan trọng Đó là nhóm của DNase, ghi nhận các trình tự đặc biệt của nucleotide, và cắt DNA tại vị trí rất đặc biệt Người ta xem nó như là chìa khóa để nghiên cứu kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant)

Nguyên tắc của phương pháp RFLP: sự đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn (restriction enzyme), là phương pháp tạo nên các đoạn cắt khác nhau phân biệt được bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các fingerprinting đặc trưng cho từng phân tử DNA Xử lý các mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn, các gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng đoạn cắt có chiều dài khác nhau, còn những gen có cấu trúc hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau

Quy trình của phương pháp RFLP

Quy trình phương pháp RFLP thông thường: - Tách chiết và tinh sạch DNA

- Cắt các mẫu DNA cần phân tích bởi cùng một enzyme cắt giới hạn - Điện di và thực hiện phản ứng lai Southern blot

Quy trình phương pháp RFLP dựa trên PCR (phương pháp RFLP-PCR): - Tách chiết DNA tổng số

- Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích - Xử lý các sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn - Phân tích trên gel các sản phẩm PCR đã được cắt

Phương pháp này đã được rất nhiều người sử dụng để nghiên cứu về sự đa dạng di truyền Năm 1988, Mc Couch và ctv đã sử dụng marker phân tử RFLP để thiết lập bản đồ di truyền trên cây lúa bao gồm 135 loci Bản đồ phủ trên 12 nhiễm sắc thể với tổng cộng 1389 cM trên genome cây lúa từ cặp lai IR34583 (Indica) và Bulu Dalam (Javanica)

Ba năm sau, Saito và ctv đã thiết lập 1 bản đồ khác dựa trên cặp lai kasalath (Indica) và FI134 (Japonica) với 347 RFLP marker, phủ trên 12 NST với tổng cộng 1.836 cM với 347 loci ( theo Nguyễn Thị Lang, 2002)

2.3.2 Phương pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism)

AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự primer, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt

Thông thường, restriction enzyme sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thường xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thường xuyên (nhằm hạn chế số lượng các đoạn cắt) Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI - MseI Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích

AFLP nhanh, không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gene Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các primer sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài) Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp

Năm 1999, Liu đã áp dụng phương pháp AFLP để phân nhóm di truyền trên cây khoai lang Ngoài ra, AFLP cũng đã được áp dụng thành công để xây dựng nên bản đồ QTL tìm được gen chịu mặn (theo Nguyễn Thị Lang, 2002)

2.3.3 Microsatellite

Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene eukaryote là những vùng có tính biến dị cao Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh Các VNTR này đặc trưng bởi số lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA như: (AC)n, (AG)n, (AT)n, (TAT)n, (TCT)n, (CAG)n … Microsatellite là các VNTR có số đơn vị trình tự lõi từ 1-6bp, số lần lặp lại của microsatellite khoảng 70 lần Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phương pháp này là rất cao

Dựa trên trình tự DNA microsatellite được bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gene, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite Kích thước các đoạn DNA được khuếch đại thường từ 100 - 200 bp Kết quả tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide

Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bước đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhược điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình Ưu điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một marker đồng trội

Microsatellite được sử dụng rất nhiều trong phân tích genome, do tính đa hình phong phú, tiết kiệm thời gian so với các phương pháp khác Tại Việt Nam, phương pháp microsatellite đã thành công trong việc phân nhóm di truyền lúa mùa địa phương, xây dựng bản đồ gen rầy nâu và xây dựng bản đồ gen kháng mặn trên lúa (Nguyễn Thị Lang, 2002)

2.3.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 1.1.1 2.3.4.1 Giới thiệu về kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện

như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn DNA bằng nhau và chiều dài các đoạn DNA tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử (marker)

trội (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước: - Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR - Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid

- Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

1.1.2 2.3.4.2 Một số vấn đề thường gặp khi thực hiện phản ứng RAPD

Nồngđộ primer tối ưu thường nằm trong khoảng từ 0,2 – 0,3 mM

Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số băng trên bảng gel điện di Vì vậy nồng độ DNA mẫu xem là thích hợp cho mỗi phản ứng: 10 – 50 ng/25 μl thể tích phản ứng

PCR buffer thường được cung cấp theo Taq - polymerase và có thể có hoặc

không có Mg2+ Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau, sự thay đổi nồng độ Mg2+thường thay đổi số lượng băng DNA trên gel

Taq - polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn Vì vậy, loại Taq - polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính xác và được xác định qua thực nghiệm Việc chọn loại Taq polymerase phù

hợp là rất quan trọng

Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf RAPD thường được tiến hành với 45 chu kỳ (KurtWeising và ctv, 1995)

2.3.4.3 Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD

Về mặt kĩ thuật : phương pháp RAPD không đòi hỏi ta phải biết trước trình tự gen của sinh vật cần nghiên cứu Số lượng DNA cần thiết ít và không cần quá tinh sạch Thời gian thực hiện ngắn, thao tác đơn giản

Về mặt kinh tế: chi phí thực hiện thấp Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá sự đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao (Nguyễn Thị Lang, 2002)

1.1.3 2.3.4.4 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD

1.1.4 Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao và không ổn định

Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao (Nguyễn Thị Lang, 2002)

1.1.5 2.3.4.5 Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:

Đánh giá đa dạng di truyền: đã được áp dụng trên các đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua.v.v Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã được áp dụng để phân tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm

khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces et de Not, Corynespora cassiicola (Nguồn: http://library.uws.edu.au/adt-NUWS/uploads/approved/adt-NUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf)

Nhận diện chỉ thị phân tử: ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gen RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang, 2002)

Ngoài ra kỹ thuật RAPD còn được áp dụng xây dựng bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002)

1.1.6 2.3.4.6 Những cải tiến của kỹ thuật RAPD

Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD được mô tả

Kỹ thuật thứ nhất là sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer như kỹ thuật RAPD thông thường Phương pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số băng so với khi sử dụng một primer Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa hình

Cải tiến thứ 2 là cắt DNA bằng các enzyme giới hạn trước hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả Một là có thể làm giảm số lượng các băng khó xác định (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lược nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt được các chỉ thị đồng trội Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và ctv, 1995)

2.4 Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của nấm R.solani

2.4.1.Nghiên cứu trong nước

Nguyễn Thị Nghiêm (1997) bằng phương pháp đánh dấu phân tử với kỹ

thuật PCR sử dụng hai primer chuyên biệt ERIC1 và ERIC2 đã chia 137 dòng nấm R solani Kühn thu thập ở đồng bằng sông Cửu Long thành 33 nhóm nấm mang tính đa

dạng di truyền khác nhau.(dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005)

Nguyễn Thị Huệ (2003), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng rDNA-ITS cho

biết hai dòng nấm R solani phân lập từ cây húng quế và cây bông cho các đoạn cắt

giới hạn có kích thước khác nhau khi được cắt bởi enzyme MboI

Hồ Viết Thế (2005), khi cắt bằng enzyme HaeIII trên vùng rDNA-ITS của 4

dòng R solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau, đều cho hai đoạn cắt giống

nhau Do đó, không thể phân tích được tính đa hình về mặt di truyền của 4 dòng này khi cắt bằng enzyme HaeIII (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005)

Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng ITS-rDNA với việc sử dụng 3 enzyme cắt TaqI, AluI, HaeIII đã nhận thấy có sự đa hình các

đoạn cắt giới hạn trong vùng rDNA-ITS của 9 dòng R solani phân lập từ các cây ký

chủ khác nhau

2.4.2 Các nghiên cứu ở nước ngoài

Ducan và ctv (1993) đã dùng phương pháp RAPD để xác định tính đa dạng

di truyền của 23 dòng nấm R solani phân lập được với các primer T7

Năm 2004, Mayee và ctv đã sử dụng phương pháp RAPD để nghiên cứu sự

đa dạng di truyền của 20 dòng nấm R.solani phân lập được trên rễ cây bông vải ở Ấn

Độ Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng 8 primer Kết quả phản ứng RAPD được xử lí đã cho thấy hệ số di truyền của các dòng nấm này khoảng từ 0,35 -1 và hệ số di truyền trung bình của mỗi nguồn nấm là 0,67

Yang và ctv (1995) đã sử dụng phương pháp RAPD để khảo sát sự đa dạng

di truyền của các dòng nấm Rhizoctonia solani từ nhiều nơi khác nhau như: Western

Australia, Newdegate, Esperance Tất cả các dòng nấm được nghiên cứu đều thuộc AG-8 (Nguồn: www.cababstractsplus.org/google/abstract.asp?AcNo=2004305722)

1999, Bounoun và các ctv cũng dựa trên phản ứng RAPD để chia nhỏ phân nhóm AG-3 thành các nhóm phụ khác nhau Họ đã sử dụng đến 40 primer Các đoạn

đặc hiệu được xác nhận bằng kỹ thuật Southern blot (Nguồn: http://www.doaj.org/doaj?func=abstract&id=44178&toc=y)

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm

17 dòng phân lập nấm R solani do Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông

Học cung cấp Các dòng nấm này được phân lập từ các phiến lá và bẹ lá lúa bị bệnh khô vằn Kí hiệu nấm và địa điểm thu thập được trình bày ở bảng 3.1

3.2.2 Những hoá chất được sử dụng trong nghiên cứu

- Natri acetate 3 M, pH 8.0

- Isopropanol 100%, Ethanol 70%

- TE 1X: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0

3.2.2.2 Những hoá chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD:

- Dung dịch đệm PCR 5X (amplification buffer): 200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl) (Promega )

- MgCl2 25 mM (Promega)