Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD đƣợc mô tả.
Kỹ thuật thứ nhất là sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer nhƣ kỹ thuật RAPD thông thƣờng. Phƣơng pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số băng so với khi sử dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa hình.
Cải tiến thứ 2 là cắt DNA bằng các enzyme giới hạn trƣớc hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả. Một là có thể làm giảm số lƣợng các băng khó xác định (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lƣợc nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt đƣợc các chỉ thị đồng trội. Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và ctv, 1995).
2.4. Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của nấm R.solani 2.4.1.Nghiên cứu trong nƣớc
Nguyễn Thị Nghiêm (1997) bằng phƣơng pháp đánh dấu phân tử với kỹ thuật PCR sử dụng hai primer chuyên biệt ERIC1 và ERIC2 đã chia 137 dòng nấm R. solani Kühn thu thập ở đồng bằng sông Cửu Long thành 33 nhóm nấm mang tính đa dạng di truyền khác nhau.(dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005)
Nguyễn Thị Huệ (2003), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng rDNA-ITS cho biết hai dòng nấm R. solani phân lập từ cây húng quế và cây bông cho các đoạn cắt giới hạn có kích thƣớc khác nhau khi đƣợc cắt bởi enzyme MboI.
Hồ Viết Thế (2005), khi cắt bằng enzyme HaeIII trên vùng rDNA-ITS của 4 dòng R. solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau, đều cho hai đoạn cắt giống nhau. Do đó, không thể phân tích đƣợc tính đa hình về mặt di truyền của 4 dòng này khi cắt bằng enzyme HaeIII. (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005)
Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng ITS-rDNA với việc sử dụng 3 enzyme cắt TaqI, AluI, HaeIII đã nhận thấy có sự đa hình các đoạn cắt giới hạn trong vùng rDNA-ITS của 9 dòng R. solani phân lập từ các cây ký chủ khác nhau.
2.4.2 Các nghiên cứu ở nƣớc ngoài
Ducan và ctv (1993) đã dùng phƣơng pháp RAPD để xác định tính đa dạng di truyền của 23 dòng nấm R. solani phân lập đƣợc với các primer T7
(GTAATACGACTCACTATAG), R1 (GTCCSTTCSGTCGGTGCT) , USP
(GTAAAACGACGGCCAGT), họ đã tạo ra nhiều sản phẩm đa dạng trên bộ gen của nấm có kích thƣớc từ 0.1 đến 1.5 kb.
Matsumoto và ctv. (1996), dựa trên phân tích RFLP của gen rDNA 28S đã chỉ ra sự khác nhau giữa 3 nhóm tiếp hợp AG-1, AG-2, và AG-4 khi cắt bằng các enzyme giới hạn BamHI, HaeIII, HhaI và HpaII.
Năm 2004, Mayee và ctv đã sử dụng phƣơng pháp RAPD để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 20 dòng nấm R.solani phân lập đƣợc trên rễ cây bông vải ở Ấn Độ. Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng 8 primer. Kết quả phản ứng RAPD đƣợc xử lí đã cho thấy hệ số di truyền của các dòng nấm này khoảng từ 0,35 -1 và hệ số di truyền trung bình của mỗi nguồn nấm là 0,67.
Yang và ctv (1995) đã sử dụng phƣơng pháp RAPD để khảo sát sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Rhizoctonia solani từ nhiều nơi khác nhau nhƣ: Western Australia, Newdegate, Esperance. Tất cả các dòng nấm đƣợc nghiên cứu đều thuộc AG-8. (Nguồn: www.cababstractsplus.org/google/abstract.asp?AcNo=2004305722)
1999, Bounoun và các ctv cũng dựa trên phản ứng RAPD để chia nhỏ phân nhóm AG-3 thành các nhóm phụ khác nhau. Họ đã sử dụng đến 40 primer. Các đoạn
đặc hiệu đƣợc xác nhận bằng kỹ thuật Southern blot. (Nguồn:
http://www.doaj.org/doaj?func=abstract&id=44178&toc=y).
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm
- Thời gian: từ 01/03/2005 đến 30/08/2005
- Địa điểm: Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Nguồn nấm 3.2.1. Nguồn nấm
17 dòng phân lập nấm R. solani do Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học cung cấp. Các dòng nấm này đƣợc phân lập từ các phiến lá và bẹ lá lúa bị bệnh khô vằn. Kí hiệu nấm và địa điểm thu thập đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
3.2.2. Những hoá chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
3.2.2.1. Những hoá chất sử dụng để li trích DNA:
- Nitơ lỏng
- Lysis buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 50 mM EDTA, 3% SDS, 1% β- mercaptoethanol. - Hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) - Hỗn hợp chloroform:izoamyl alcohol (24:1) - Natri acetate 3 M, pH 8.0 - Isopropanol 100%, Ethanol 70% - TE 1X: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
3.2.2.2. Những hoá chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD:
- Dung dịch đệm PCR 5X (amplification buffer): 200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl) (Promega )
- dNTP 10 mM (gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Promega) - Taq DNA polymerase 5 UI/µl (Promega)
- Primer (Bảng 3.2)
Bảng 3.1. Kí hiệu và địa điểm thu thập 17 dòng phân lập nấm R. Solani đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 3.2. Tên và trình tự của các primer đã sử dụng trong nghiên cứu
Tên primer Trình tự (5’- 3’)
OPL-08 AGCAGGTGGA
OPL-05 GGGCGGTACT
STT Kí hiệu nấm Địa điểm thu thập
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 L31 L38 L50 L54 L55 L56 L58 L59 L61 L63 L64 L651 L66 L72 L75 L781 L79 Cát Hải, Hải Phòng Quỳnh Lƣu, Nghệ An
Dakmil, Dak Lak Phú Lộc, Thừa Thiên- Huế
Đức Phổ, Quãng Ngãi Tuy Phƣớc, Bình Định Ninh Hoà, Khánh Hoà
Chƣ Xê, Gia Lai Nhơn Trạch, Đồng Nai
Đạ Tẻh, Lâm Đồng Châu Đức, Bà Rịa Vũng Tàu
Đồng Xoài, Bình Phƣớc Tân Châu, Tây Ninh Cần Đƣớc, Long An Giồng Trôm, Bến Tre
Hồng Dân, Bạc Liêu Mỹ Tú, Sóc Trăng
OPM-13 GGTGGTCAAG
3.2.2.3. Những hoá chất sử dụng để điện di sản phẩm RAPD
- Agarose - TAE 0,5X - Loading dye 6X
- Ethidium bromide
3.2.3. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
3.2.3.1. Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong ly trích:
- Khay đựng nitơ - Cối và chày sứ - Eppendorf 1,5 ml - Micropipette các loại - Đầu tip các loại
- Bồn ủ nhiệt (water bath) - Máy vortex
- Máy ly tâm lạnh - Tủ 4oC và - 20o
C
3.2.3.2. Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong phản ứng RAPD:
- Hộp đá khô -20oC - Eppendorf 0,2 ml
- Micropipette 10 µl, 100 µl và các loại đầu tip tƣơng ứng - Máy luân nhiệt
- Tủ thao tác vô trùng
3.2.3.3. Các dụng cụ và thiết bị dùng trong điện di
- Cân kĩ thuật 4 số - Lò viba
- Bồn và máy điện di (Bio-rad) - Máy chụp hình gel (Gel doc).
- Ống đong
3.3. Phƣơng pháp tiến hành
3.3.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani
Quy trình ly trích DNA tổng số: dựa trên quy trình đƣợc đề xuất bởi Lee và Taylor (1990), đã đƣợc Nguyễn Thị Tiến Sỹ cải tiến năm 2005.
Quy trình ly trích DNA tổng số
- Nghiền 0,1 – 0,3 g sợi nấm đã đƣợc làm khô kiệt trong nitơ lỏng.
- Thêm 600 µl lysis buffer và vortex cho tới khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer (cho tới 700 µl).
- Ủ 30 phút ở 65oC.
- Thêm một thể tích tƣơng ứng (600 µl) hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1), và lắc nhẹ.
- Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. - Chuyển dịch nổi (khoảng 400 µl) vào một ống eppendorf mới.
- Thêm 400 µl hỗn hợp chloroform, izoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ. Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (25 – 28o
C). - Hút lấy dịch nổi (khoảng 200 µl) vào một eppendorf mới.
- Kết tủa DNA bằng cách thêm 0,03 thể tích natri acetate 3M (6 µl) và 0,5 thể tích isopropanol (100 µl). Trộn nhẹ nhàng nhƣng cẩn thận.
- Ly tâm 5 phút (14000 vòng/phút ở 4oC)
- Loại bỏ dịch nổi, rửa phần kết tủa 3 lần với ethanol 70% lạnh.
- Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với một thể tích TE 1X (từ 50-100 µl) và trữ ở 4oC hoặc -20oC cho đến khi sử dụng.
- Kiểm tra sự có mặt và độ tinh sạch của DNA bằng cách điện di trên gel agarose.
Phản ứng RAPD đƣợc thực hiện theo qui trình do Ducan và các cvt đề xuất năm 1993 (Bảng 3.3 và 3.4). Tuy nhiên khi thực hiện phản ứng RAPD theo qui trình này chúng tôi thấy thời gian thực hiện phản ứng quá dài (5 giờ), lƣợng hoá chất sử dụng quá nhiều cho một phản ứng và sản phẩm cũng chƣa thật tốt . Do đó, qui trình cần đƣợc tối ƣu để có thể rút ngắn thời gian thực hiện và có kết quả tốt .
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD
Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (45 chu kỳ)
Tách DNA khuôn Ủ bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94oC 94oC 36oC 72oC 72oC 2 phút 1 phút 1 phút 2 phút 7 phút
Bảng 3.4. Thành phần hoá chất để thực hiện phản ứng RAPD
Hoá chất phản ứng Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PRC buffer MgCl2 dNTP’S Primer Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 5X 25 mM 10 mM 10 mM 5U/µl 20-50 ng/µl 5 µl 3 µl 1 µl 0,75 µl 0, 3µl 2 µl 11, 75 µl 1X 3 mM 0,4 mM 0,3 mM 1,5 U 20 -50 ng Tổng 25 µl
3.3.2.1. Thí nghiệm 1 : Khảo sát số lượng chu kì phản ứng :
Mục đích của nghiệm thức này là khảo sát sự ảnh hƣởng của số chu kì nhiệt của phản ứng lên kết quả của phản ứng RAPD.
Chu trình nhiệt đƣợc thực hiện theo bảng 3.3 với số chu kì lần lƣợt thay đổi là 35, 40 và 45.
Kết quả khảo sát đƣợc phân tích trên gel agarose 2%
Đánh giá kết quả: dựa vào số băng hình thành và sự thể hiện rõ các băng.
3.3.2.2. Thí nghhiệm 2 : Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD:
a/ Thí nghiệm 2.1 : Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ MgCl2 và primer lên phản ứng RAPD
Mục đích: Xác định nồng độ MgCl2 và primer thích hợp cho phản ứng RAPD cho các dòng phân lập nấm R.solani.
Nồng độ của MgCl2 và primer đƣợc lần lƣợt thay đổi trong các nghiệm thức để có thể tìm thấy nồng độ thích hợp nhất cho phản ứng RAPD (bảng 3.6). Các thành phần còn lại đƣợc giữ nguyên nhƣ ở bảng 3.4.
Kết quả khảo sát đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel.
Đánh giá kết quả: số băng hình thành, độ rõ của các băng sản phẩm và không xuất hiện tạp.
Bảng 3.5. Nồng độ MgCl2 và primer đƣợc khảo sát trong thí nghiệm 2.1
Nghiệm thức Hóa chất Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối 1 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 3μl 0,75 μl 3 mM 0,3 mM 2 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 3,5 μl 0,75 μl 3,5 mM 0,3 mM 3 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 4 μl 0,75 μl 4 mM 0,3 mM 4 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 4 μl 1μl 4 mM 0,4 mM 5 MgCl2 25 mM 4 μl 4 mM
b/ Thí nghiệm 2.2 : Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq polymerase và DNA mẫu lên phản ứng RAPD
Mục đích: Xác định nồng độ Taq polymerase và DNA mẫu thích hợp cho phản ứng RAPD trên nấm R.solani.
Sau khi đã chọn đƣợc nồng độ MgCl2 và primer thích hợp trong thí nghiệm 2.1, thí nghiệm 2.2 đƣợc thực hiện với nồng độ của Taq polymerase và DNA mẫu lần lƣợt thay đổi (bảng 3.7). Buffer, dNTP’S giữ nguyên nồng độ nhƣ ở bảng 3.4. Nồng độ MgCl2 và primer là nồng độ tối ƣu đã thu đƣợc trong thí nghiệm 2.1.
Kết quả khảo sát đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel.
Đánh giá kết quả: số băng hình thành, độ rõ của các băng sản phẩm và không xuất hiện tạp.
Bảng 3.6. Nồng độ DNA mẫu và Taq polymerase đƣợc khảo sát trong thí nghiệm 2.2 Primer 10 mM 0.5 μl 0,2 mM Nghiệm thức Hoá chất Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
3.3.3. Thực hiện phản ứng RAPD:
Phản ứng RAPD đƣợc thực hiện theo qui trình nhiệt và thành phần hoá chất đã đƣợc tối ƣu sau các thí nghiệm trên. Kết quả phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 2%. Các băng sản phẩm điện di sẽ đƣợc mã hoá và xử lí bằng phần mềm NTYSYSpc 2.1.
3.3.4. Điện di sản phẩm RAPD
Quy trình thực hiện
Cho 0.5g agarose vào 25 ml dung dịch TAE 0,5X (nồng độ 2%). Đun sôi hỗn hợp trên khoảng hai phút trong lò viba.
Để nguội ở nhiệt độ phòng còn khoảng 50o
C.
Đổ gel vào khay (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí khi đổ gel.
Để gel đông đặc lại ở nhiệt độ phòng, rút lƣợc ra khỏi gel, cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TAE 0,5X.
Trộn 10µl sản phẩm RAPD với 4µl loading dye và cho vào giếng của gel. Vận hành máy điện di ở 50V trong khoảng 50 – 60 phút.
1 DNA mẫu Taq polymerase 20 - 50ng/µl 5 U/µl 2 µl 0,2 µl 1 U 2 DNA mẫu Taq polymerase 20-50 ng/µl 5 U/µl 2 µl 0,25 µl 1,25 U 3 DNA mẫu Taq polymerase 20-50 ng/µl 5 U/µl 2 µl 0,3 µl 1,5 U 4 DNA mẫu Taq polymerase 20-50 ng/µl 5 U/µl 1 µl 0,25 µl 1,25 U
Đọc kết quả điện di.
1.1.6.1. 3.3.5. Phân tích kết quả RAPD
Các băng thu được từ kết quả điện di RAPD được mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1, băng nào có thì chuyển thành 1, băng không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa được lưu dưới dạng file excel (xls) và chuyển sang phần mềm NTSYS phiên bản 2.1 để xử lý. Sơ đồ phân nhóm (dendrogram) và ma trận tương đồng được xây dựng bởi chương trình similarity và SAHN- UPGMA.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả ly trích DNA tổng số của nấm R.solani
Ly trích DNA là một quá trình quan trọng có tính quyết định để thực hiện các phản ứng tiếp theo trong các kỹ thuật nhƣ RAPD, PCR, RFLP... Nếu sản phẩm ly trích lúc đầu không tinh sạch, có quá nhiều tạp chất hoặc DNA bị đứt gãy thì khi thực hiện các phản ứng sẽ không có đƣợc sản phẩm hoặc có thêm những sản phẩm không mong muốn.
Đối với phản ứng RAPD, để có kết quả tốt và chính xác thì cần phải có những mẫu DNA tinh sạch. Theo qui trình li trích đã nêu ở mục 3.3.1, chúng tôi đã thu đƣợc những mẫu DNA khá tinh sạch để có thể thực hiện phản ứng RAPD (hình 4.1).
Hình 4.1 Ảnh điện di DNA tổng số của các dòng phân lập nấm R. solani.
1:L31, 2: L38, 3: L50, 4: L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: L61, 10: L63, 11: L64, 12: L651, 13: L66, 14: L72, 15: L75, 16 : L781, 17: L79
Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005) đã li trích DNA tổng số của R. solani theo qui trình của Lee và Taylor (1990) có bổ sung thêm bƣớc li trích với hỗn hợp chloroform :izoamyl alcohol. Trong nghiên cứu này, DNA tổng số đã đƣợc li trích theo qui trình li trích của Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005) đã cải tiến nhƣng rút ngắn thời gian ủ các eppendorp chứa sợi nấm nghiền và lysis buffer ở 650C từ 1 giờ xuống còn 30 phút để tiết kiệm thời gian hơn nhƣng sản phẩm li trích vẫn rất tốt. Nhƣ vậy, qui trình mà chúng tôi đã thực hiện là khá tốt cho việc li trích DNA của nấm R.solani và rút ngắn đƣợc thời gian hơn so với qui trình của Nguyễn Thị Tiến Sỹ đã thực hiện.
4.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD4.2.1. Lƣợng DNA mẫu 4.2.1. Lƣợng DNA mẫu
Lƣợng DNA mẫu ảnh hƣởng rất lớn lên kết quả của phản ứng RAPD. Nếu