Các băng thu được từ kết quả điện di RAPD được mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1, băng nào có thì chuyển thành 1, băng không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa được lưu dưới dạng file excel (xls) và chuyển sang phần mềm NTSYS phiên bản 2.1 để xử lý. Sơ đồ phân nhóm (dendrogram) và ma trận tương đồng được xây dựng bởi chương trình similarity và SAHN- UPGMA.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả ly trích DNA tổng số của nấm R.solani
Ly trích DNA là một quá trình quan trọng có tính quyết định để thực hiện các phản ứng tiếp theo trong các kỹ thuật nhƣ RAPD, PCR, RFLP... Nếu sản phẩm ly trích lúc đầu không tinh sạch, có quá nhiều tạp chất hoặc DNA bị đứt gãy thì khi thực hiện các phản ứng sẽ không có đƣợc sản phẩm hoặc có thêm những sản phẩm không mong muốn.
Đối với phản ứng RAPD, để có kết quả tốt và chính xác thì cần phải có những mẫu DNA tinh sạch. Theo qui trình li trích đã nêu ở mục 3.3.1, chúng tôi đã thu đƣợc những mẫu DNA khá tinh sạch để có thể thực hiện phản ứng RAPD (hình 4.1).
Hình 4.1 Ảnh điện di DNA tổng số của các dòng phân lập nấm R. solani.
1:L31, 2: L38, 3: L50, 4: L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: L61, 10: L63, 11: L64, 12: L651, 13: L66, 14: L72, 15: L75, 16 : L781, 17: L79
Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005) đã li trích DNA tổng số của R. solani theo qui trình của Lee và Taylor (1990) có bổ sung thêm bƣớc li trích với hỗn hợp chloroform :izoamyl alcohol. Trong nghiên cứu này, DNA tổng số đã đƣợc li trích theo qui trình li trích của Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005) đã cải tiến nhƣng rút ngắn thời gian ủ các eppendorp chứa sợi nấm nghiền và lysis buffer ở 650C từ 1 giờ xuống còn 30 phút để tiết kiệm thời gian hơn nhƣng sản phẩm li trích vẫn rất tốt. Nhƣ vậy, qui trình mà chúng tôi đã thực hiện là khá tốt cho việc li trích DNA của nấm R.solani và rút ngắn đƣợc thời gian hơn so với qui trình của Nguyễn Thị Tiến Sỹ đã thực hiện.
4.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD4.2.1. Lƣợng DNA mẫu 4.2.1. Lƣợng DNA mẫu
Lƣợng DNA mẫu ảnh hƣởng rất lớn lên kết quả của phản ứng RAPD. Nếu nồng độ DNA mẫu quá cao trong một phản ứng, nó sẽ làm ức chế phản ứng, làm phản ứng không có sản phẩm hoặc có nhiều sản phẩm phụ mà ta không mong muốn.
Trong phản ứng RAPD, lƣợng DNA mẫu tối ƣu là khoảng 20-50 ng/µl. Do đó, trƣớc khi thực hiện phản ứng, chúng tôi đã tiến hành pha loãng mẫu để đạt đƣợc nồng độ DNA mong muốn. Tuỳ vào nồng độ của DNA tổng số mà pha loãng theo các mức độ khác nhau. DNA sau khi pha loãng đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose nồng độ 0.8% cùng với 1 mẫu DNA chuẩn có nồng độ 20 -50 ng. Khi các băng điện di trong các mẫu pha loãng có nầng độ DNA ngang bằng với băng của mẫu DNA chuẩn thì các các mẫu pha loãng đã đạt đƣợc nồng độ DNA mong muốn.
Hình 4.2 Ảnh điện di DNA của các dòng phân lập nấm R. Solani sau khi pha loãng. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: L61, 10: L63, 11: L64, 12: L651, 13: L66, 14: L72, 15: L75, 16 : L781, 17: L79, 18: băng
DNA chuẩn
4.2.2. Khảo sát chu kì phản ứng:
RAPD dùng trong thí nghiệm này đƣợc thực hiện theo qui trình nhiệt do Ducan và các cộng sự đề xuất năm 1993. Chu trình nhiệt này có 45 chu kỳ và bao gồm: quá trình biến tính 940C trong 1 phút, bắt cặp: 360C trong 1 phút và 720
C trong 2 phút. Nhằm tiết kiệm thời gian mà vẫn có đƣợc kết quả tốt, chúng tôi đã tiến hành khảo sát số chu kì phản ứng của quy trình nhiệt lần lƣợt là 35, 40 và 45 chu kì. Kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở hình 4.3.
Hình 4.3. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L651 với primer OPL-08 ở các số chu kì khác nhau của quy trình nhiệt. 1: 35 chu kì, 2: 45 chu kì, 3: 40
chu kì
Hình 4.3 cho thấy, khi phản ứng RAPD thực hiện ở 35 chu kì, các băng có xuất hiện nhƣng rất mờ. Giữa 40 và 45 chu kì, sản phẩm phản ứng hầu nhƣ không có khác biệt gì nhiều về chất lƣợng sản phẩm. Các băng nhiều và rõ. Do đó, qui trình nhiệt có 40 chu kì đƣợc chọn để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo.
4.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD:
Để phản ứng RAPD cho phản ứng tối ƣu nhất thì cần có sự tƣơng thích giữa các thành phần hoá chất trong phản ứng. Vì thế, với mục đích tối ƣu hoá phản ứng chúng tôi đã thay đổi lần lƣợt nồng độ của các chất trong phản ứng RAPD. Trƣớc hết chúng tôi đã khảo sát kết hợp 5 nồng độ của MgCl2 và primer. Các kết quả đƣợc thể hiện trong hình 4.4:
Hình 4.4. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với các nồng độ MgCl2 và primer khác nhau. Lane 1-3: MgCl2: 3 mM, 4 mM,
4,5 mM, primer: 0,3 mM, lane 4-5: MgCl2: 4 mM, primer: 0,4mM, 0,5 mM Qua hình 4.4 cho thấy nghiệm thức thứ 5 (MgCl2: 4 mM, primer: 0,2 mM cho kết quả tốt nhất. Số băng nhiều nhiều và rõ. Đối với nghiệm thức 1 và 2 nồng độ MgCl2 (3 mM và 3.5 mM)quá thấp, làm giảm số băng sản phẩm điện di. Nồng độ primer cao cũng làm ức chế số lƣợng sản phẩm. Ở nghiệm thức 3,4 và 5 cùng
nồng độ MgCl2 (4 mM) nhƣng với nồng độ primer cao hơn (0,3 mM và 0,4 mM), số băng sản phẩm của nghiệm thức 3 và 4 ít hơn hẳn so với nghiệm thức 5. Nhƣ vậy, qua thí nghiệm 2.1, chúng tôi đã chọn nghiệm thức 5 với nồng độ của MgCl2 (4 mM) và primer (0,2 mM) khá tốt cho phản ứng RAPD.(bảng 4.1).
Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L 66 và primer OPL-05 với các nồng độ Taq và DNA mẫu khác nhau. Lane 1-3: Taq: 0,2 µl, 0,25µl,
0,3µl, DNA mẫu: 2µl, lane 4: taq: 0,25µl, DNA mẫu: 1µl
Sau khi xác định đƣợc nồng độ của MgCl2 và primer cho RAPD, chúng tôi đã tiếp tục khảo sát 4 nồng độ khác nhau của Taq polymerase kết hợp với DNA mẫu. Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 4.5. Thí nghiệm khảo sát nồng độ Taq và DNA mẫu (thí nghiệm 2.2) đƣợc thực hiện với nồng độ MgCl2 (4 mM) và primer
(0,2 mM) đã đƣợc xác định trƣớc đó. Ở thí nghiệm này, nghiệm thức 4 (Taq: 0,25µl và DNA mẫu: 1µl) cho kết quả tốt nhất. Ở nghiệm thức 1, lƣợng Taq ít (0,2 µl) nên không cho sản phẩm. Lƣợng Taq quá cao cũng ức chế phản ứng, tạo ít băng sản phẩm. Ngoài ra, lƣợng DNA mẫu cao (2 µl) cũng là 1 nguyên nhân ức chế phản ứng.
Nhƣ vậy, nghiệm thức 4 đƣợc lựa chọn để thực hiện phản ứng RAPD của các dòng phân lập nấm R. solani trong khoá luận này.
Sau khi thực hiện các thí nghiệm đã thu đƣợc thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD khá tốt. Thành phần hoá chất này đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và đƣợc sử dụng để khảo sát sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani.
Bảng 4.1. Thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD đƣợc sử dụng để khảo sát sự đa dạng di truyền của R. solani
Hoá chất Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ CUỐI Buffer MgCl2 dNTP’S primer Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 5X 25 mM 10 mM 10 mM 5U 20-50 ng 5 µl 4 µl 1 µl 0,5 µl 0.25 µl 1µl 13,25 µl 1X 4 mM 0,4 mM 0,2 mM 1,25 U 20- 50 ng Tổng 25 µl
4.3. Phản ứng RAPD của các dòng phân lập nấm R. solani
Sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R.solani đƣợc khảo sát bằng phản ứng RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05, OPL-08. Sản phẩm của phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 2%. Các đoạn DNA có cùng trọng lƣợng phân tử sẽ di chuyển đến cùng một vị trí trên gel. Sự khác biệt giữa các dòng nấm đƣợc thể hiện bằng sự khác biệt về số lƣợng và vị trí của các băng DNA trên gel
Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPM-13. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9:
L61, 10:L63, 11: L64, 12: L651, 13: L66, 14: L72, 15: L75, 16 : L781, 17: L79
Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng nấm R.solani với primer OPL - 05. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7:ladder, 8: L58, 9: L59, 10: L61, 11: L63, 12: L64, 13: L651, 14: L66, 15: L72, 16 : L75, 17: L781, 18: L79
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng nấm R.solani với primer OPL - 08. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: ladder, 10: L61, 11: L63, 12: L64, 13: L651, 14: L66, 15: L72, 16 : L75, 17: L781, 18: L79
Hình 4.6, 4.7 và 4.8 cho thấy cả 3 primer đều bắt cặp và cho ra những sản phẩm khá tốt với DNA của các dòng nấm R.solani. Với 2 primer OPL-08 và OPL- 05, sản phẩm RAPD tạo ra nhiều băng và đa số là các băng đa hình và chỉ có một băng đồng hình (primer OPM-13). Các băng này có kích thƣớc từ 100 đến 2000 bp. Đối với primer OPM-13, số băng không nhiều và nhỏ ( 100 đến 800 bp) nhƣng hầu hết là các băng đa hình.
Qua hình 4.6, 4.7, và 4.8 ngoài các băng rõ còn có một số băng bị mờ hoặc hình điện di bị nhoè không rõ băng. Điều này có thể là do quá trình điện di không tốt làm cho băng tách không rõ. Cũng có thể là do điện cực bị cong. Ngoài ra, các băng mờ còn có thể do thao tác PCR không tốt hoặc qui trình chƣa phù hợp làm giảm lƣợng sản phẩm. Ngoài ra, sự tƣơng quan giữa nồng độ của các chất trong hỗn hợp phản ứng chƣa thật sự phù hợp hoàn toàn với nhau và với từng primer khác nhau cũng là nguyên nhân quan trọng làm sản phẩm RAPD không đƣợc tốt.
Primer OPM-13 chỉ cho tối đa 5 băng sản phẩm (hình 4.6). Đây là primer cho sản phẩm có số băng ít nhất trong 3 primer đƣợc sử dụng. Tuy nhiên, các băng sản phẩm hầu nhƣ đều đa hình, chỉ có 1 băng đồng hình khoảng 300bp. Có 3 dòng nấm L61, L66 và L72 chỉ cho có 2 băng : 1 băng đồng hình và 1 băng đa hình. Điều này có thể là do đặc điểm di truyền của các dòng nấm làm hạn chế sự bắt cặp. Tuy vậy, 3 băng đa hình của 3 dòng nấm này có kích thƣớc khác nhau nên vẫn phân biệt đƣợc 3 dòng nấm này với nhau và với các dòng nấm khác trong đƣợc nghiên cứu trong khoá luận này. Băng sản phẩm lớn nhất 800bp chỉ xụất hiện duy nhất ở dòng nấm L64. Do đó có thể tiếp tục nghiên cứu primer này nhƣ chỉ thị phân tử cho các dòng nấm L61, L64, L66 và L72.
Primer OPL-05 cho ra nhiều băng sản phẩm hơn trên các dòng nấm (hình 4.7). Cao nhất là 10 băng. Với primer này cũng không có dòng nấm nào cho sản
phẩm RAPD giống nhau và tất cả các băng đều đa hình. Các băng do primer này tạo ra có kích thƣớc khá lớn ( khoảng 250 bp đến 2 kb).
Primer OPL-08 cho 11 băng sản phẩm, kích thƣớc khoảng 150 bp đến 1500bp (hình 4.8). Tất cả các băng đều là đa hình. Dòng nấm L61 chỉ cho 2 băng 350 bp và 550 bp, do đó có thể dễ dàng phân biệt dòng nấm này với 16 dòng nấm còn lại. Các dòng nấm L55, L56 và L58 có sản phẩm RAPD hoàn toàn giống nhau. Điều đó này cho thấy primer OPL-08 không thích hợp làm chỉ thị để phân biệt 3 dòng nấm này.
4.4. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani
Kết quả điện di sản phẩm RAPD đƣợc mã hoá dạng nhị phân, có băng ghi 1, không có băng ghi 0 (Phụ lục ). Số liệu thu đƣợc đem xử lí bằng phần mềm NTSYS 2.1. Kết quả đƣợc hiển thị theo bảng ma trận tỷ lệ tƣơng đồng (bảng 4.2) và sơ đồ phân nhóm (hình 4.9)
Hình 4.9. Sơ đồ phân nhóm của 17 dòng phân lập nấm R.solani dựa trên kết quả RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05 và OPL-08
Qua hình 4.9 cho thấy tỷ lệ tƣơng đồng di truyền của 17 dòng nấm sử dụng trong nghiên cứu này biến thiên từ 53 - 89 %. Sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) có nhiều nhánh, từ đó cho thấy có sự đa dạng di truyền giữa các dòng nấm nghiên cứu.
17 dòng phân lập nấm R. solani đƣợc chia làm 2 nhóm lớn nhƣ sau :
Nhóm 1 (N1) gồm 2 dòng nấm : L31, L38 có tỷ lệ tƣơng đồng khoảng 58%. Hai dòng nấm này có cùng hệ số di truyền, từ đó có thể thấy sự di truyền của 2 dòng nấm này có thể tƣơng đƣơng nhau.
Nhóm 2 (N2) là 1 nhóm lớn gồm 15 dòng nấm có tỷ lệ tƣơng đồng khoảng 56 - 89% . Trong nhóm này thì dòng nấm L66 (N2.1) có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền thấp nhất : 56% với các dòng nấm còn lại. Điều này cho thấy dòng nấm L66 rất khác biệt so với 14 dòng nấm còn lại. 14 dòng nấm còn lại (N2.2), có thể chia thành 2 nhóm nhỏ hơn :
- N2.1.1 gồm 12 dòng nấm L50, L54, L55, L56, L58, L59, L61, L651, L72, L75, L781 và L79 có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 63 - 89%. Nhánh này chia làm nhiều nhánh nhỏ khác nhau. Điều này cho thấy là các dòng nấm này có cùng nguồn gốc nhƣng đã phân chia theo nhiều hƣớng khác nhau để thích nghi với môi trƣờng sống. Dựa vào sơ đồ phân nhóm ta có thể thấy di truyền của các dòng nấm khá xa nhau, nhƣ vậy có khả năng là sự mẫn cảm với thuốc bảo vệ thực vật của chúng có thể khác nhau.
- N2.1.2 gồm 2 dòng nấm L63 và L64 với tỷ lệ tƣơng đồng là 68%. Hai dòng nấm này cùng chung 1 nhánh nên tuy hệ số tƣơng đồng của 2 dòng nấm này
khá thấp (68%) nhƣng xét về tƣơng quan di truyền thì 2 dòng nấm này có quan hệ gần nhau hơn so với tƣơng quan di truyền với 15 dòng nấm còn lại.
Sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) còn cho thấy sự khác biệt của các dòng nấm phân lập từ các vùng địa lí khác nhau. Hai dòng nấm L31 (Hải Phòng) và L38 (Nghệ An) (N1) thu thập từ miền Bắc và Bắc Trung bộ có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khá thấp với 15 dòng phân lập còn lại đƣợc thu thập tại miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên. Điều này có thể là do khí hậu của miền Bắc và Bắc Trung bộ có 4 mùa rõ rệt và thƣờng có mùa đông rất lạnh nên các dòng nấm đã tự biến đổi nhằm phù hợp với vùng địa lí sinh sống.
Trong 15 dòng phân lập nấm R. solani còn lại đƣợc thu thập từ miền Trung (L54, L55, L56, L58), Tây Nguyên (L50, L59, L63) và miền Nam (8 dòng còn lại) thì các dòng nấm phân lập từ Tây Nguyên có quan hệ khá gần với các dòng đƣợc phân lập từ miền Trung (tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 65-84%), ngoại trừ dòng L63 (Lâm Đồng) có tƣơng quan di truyền rất gần với dòng L64 (Vũng Tàu) thu thập tại miền Đông Nam bộ (hình 4.9). Điều này cho thấy các dòng phân lập nấm R. solani
đƣợc thu thập tại các vùng địa lí lân cận nhau thì sẽ có tƣơng quan di truyền gần nhau. 12 dòng phân lậpở miền Trung, Tây Nguyên và miền Nam (N2.1.1) có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 64% và chia làm 2 nhóm nhỏ trên sơ đồ phân nhóm. Hai nhóm này có chung một gốc. Điều này chứng tỏ các dòng phân lập nấm R. solani ở miền Trung, Tây Nguyên và miền Nam có chung một nguồn gốc nhƣng đã tiến hoá theo hai hƣớng khác nhau để phù hợp với môi trƣờng mới.
Các dòng phân lập nấm R. solani ở miền Nam cũng phân thành 2 nhóm rõ