Kết quả điện di sản phẩm RAPD đƣợc mã hoá dạng nhị phân, có băng ghi 1, không có băng ghi 0 (Phụ lục ). Số liệu thu đƣợc đem xử lí bằng phần mềm NTSYS 2.1. Kết quả đƣợc hiển thị theo bảng ma trận tỷ lệ tƣơng đồng (bảng 4.2) và sơ đồ phân nhóm (hình 4.9)
Hình 4.9. Sơ đồ phân nhóm của 17 dòng phân lập nấm R.solani dựa trên kết quả RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05 và OPL-08
Qua hình 4.9 cho thấy tỷ lệ tƣơng đồng di truyền của 17 dòng nấm sử dụng trong nghiên cứu này biến thiên từ 53 - 89 %. Sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) có nhiều nhánh, từ đó cho thấy có sự đa dạng di truyền giữa các dòng nấm nghiên cứu.
17 dòng phân lập nấm R. solani đƣợc chia làm 2 nhóm lớn nhƣ sau :
Nhóm 1 (N1) gồm 2 dòng nấm : L31, L38 có tỷ lệ tƣơng đồng khoảng 58%. Hai dòng nấm này có cùng hệ số di truyền, từ đó có thể thấy sự di truyền của 2 dòng nấm này có thể tƣơng đƣơng nhau.
Nhóm 2 (N2) là 1 nhóm lớn gồm 15 dòng nấm có tỷ lệ tƣơng đồng khoảng 56 - 89% . Trong nhóm này thì dòng nấm L66 (N2.1) có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền thấp nhất : 56% với các dòng nấm còn lại. Điều này cho thấy dòng nấm L66 rất khác biệt so với 14 dòng nấm còn lại. 14 dòng nấm còn lại (N2.2), có thể chia thành 2 nhóm nhỏ hơn :
- N2.1.1 gồm 12 dòng nấm L50, L54, L55, L56, L58, L59, L61, L651, L72, L75, L781 và L79 có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 63 - 89%. Nhánh này chia làm nhiều nhánh nhỏ khác nhau. Điều này cho thấy là các dòng nấm này có cùng nguồn gốc nhƣng đã phân chia theo nhiều hƣớng khác nhau để thích nghi với môi trƣờng sống. Dựa vào sơ đồ phân nhóm ta có thể thấy di truyền của các dòng nấm khá xa nhau, nhƣ vậy có khả năng là sự mẫn cảm với thuốc bảo vệ thực vật của chúng có thể khác nhau.
- N2.1.2 gồm 2 dòng nấm L63 và L64 với tỷ lệ tƣơng đồng là 68%. Hai dòng nấm này cùng chung 1 nhánh nên tuy hệ số tƣơng đồng của 2 dòng nấm này
khá thấp (68%) nhƣng xét về tƣơng quan di truyền thì 2 dòng nấm này có quan hệ gần nhau hơn so với tƣơng quan di truyền với 15 dòng nấm còn lại.
Sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) còn cho thấy sự khác biệt của các dòng nấm phân lập từ các vùng địa lí khác nhau. Hai dòng nấm L31 (Hải Phòng) và L38 (Nghệ An) (N1) thu thập từ miền Bắc và Bắc Trung bộ có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khá thấp với 15 dòng phân lập còn lại đƣợc thu thập tại miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên. Điều này có thể là do khí hậu của miền Bắc và Bắc Trung bộ có 4 mùa rõ rệt và thƣờng có mùa đông rất lạnh nên các dòng nấm đã tự biến đổi nhằm phù hợp với vùng địa lí sinh sống.
Trong 15 dòng phân lập nấm R. solani còn lại đƣợc thu thập từ miền Trung (L54, L55, L56, L58), Tây Nguyên (L50, L59, L63) và miền Nam (8 dòng còn lại) thì các dòng nấm phân lập từ Tây Nguyên có quan hệ khá gần với các dòng đƣợc phân lập từ miền Trung (tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 65-84%), ngoại trừ dòng L63 (Lâm Đồng) có tƣơng quan di truyền rất gần với dòng L64 (Vũng Tàu) thu thập tại miền Đông Nam bộ (hình 4.9). Điều này cho thấy các dòng phân lập nấm R. solani
đƣợc thu thập tại các vùng địa lí lân cận nhau thì sẽ có tƣơng quan di truyền gần nhau. 12 dòng phân lậpở miền Trung, Tây Nguyên và miền Nam (N2.1.1) có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 64% và chia làm 2 nhóm nhỏ trên sơ đồ phân nhóm. Hai nhóm này có chung một gốc. Điều này chứng tỏ các dòng phân lập nấm R. solani ở miền Trung, Tây Nguyên và miền Nam có chung một nguồn gốc nhƣng đã tiến hoá theo hai hƣớng khác nhau để phù hợp với môi trƣờng mới.
Các dòng phân lập nấm R. solani ở miền Nam cũng phân thành 2 nhóm rõ rệt với tỷ lệ tƣơng đồng là 67% cho hai miền Đông Nam bộ và Tây Nam bộ. Các dòng nấm phân lập tại các tỉnh Tây Nam bộ (L72, L75, L781, L79) có sự di truyền gần nhau hơn với tỷ lệ tƣơng đồng di truyền lên đến 76% (hình 4.9). Trong khi đó, các dòng nấm phân lập từ các tỉnh vùng Đông Nam bộ (L61, L64, L651, L66) có tỷ lệ tƣơng đồng khá thấp, chỉ khoảng 66%. Hơn nữa, hai dòng nấm L64 và L66 có hệ số tƣơng đồng khá thấp (56 và 66%) và tách biệt khỏi nhóm của các dòng phân lập nấm thu thập từ miền Trung và miền Nam trên sơ đồ phân nhóm (hình 4.9). Điều
này cho thấy đã có sự phát sinh những dòng nấm mới để phù hợp với sự thay đổi của môi trƣờng.
Ngoài ra, giữa các dòng phân lập nấm R. solani còn cho thấy sự khác biệt giữa các dòng nấm thu thập từ các vùng đất cao và thấp. Tỷ lệ tƣơng đồng di truyền giữa 2 dòng nấm L50 (thu thập ở Daklak) và L781 (thu thập ở Sóc Trăng) chỉ có 49%. Hay tỷ lệ tƣơng đồng của dòng phân lập R. solani thu thập tại Lâm Đồng (L63) và dòng nấm thu thập tại Sóc Trăng (L781) cũng chỉ có 49%. Điều này có thể là do sự khác biệt về khí hậu, nhiệt độ, ẩm độ và cả cách canh tác của các vùng này.
Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng di truyền (bảng 4.2) cũng cho thấy rằng : các dòng phân lập nấm R.solani ở các tỉnh gần nhau thì thƣờng gần giống nhau. Ví dụ các dòng phân lập R. solani thu thập từ Bạc Liêu và Sóc Trăng có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khá cao: 89% và tƣơng quan di truyền rất gần nhau (hình 4.9). Hay giữa 2 dòng phân lập R. solani thu thập từ Bình Định và Quãng Ngãi có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 84%. Điều này cho thấy các dòng phân lập nấm R. solani ở các vùng lân cận nhau sẽ có di truyền tƣơng tự nhau. Nhƣ vậy, có khả năng sự đáp ứng với các biện pháp phòng trừ của các dòng nấm ở các vùng lân cận nhau sẽ tƣơng tự nhau. Điều này sẽ giúp cho việc đƣa ra các biện pháp phòng trừ nấm bệnh một cách tốt hơn.
Trong 17 dòng nấm phân lập dùng trong nghiên cứu này thì có dòng nấm L66 thu thập tại Tân Châu, Tây Ninh là có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền thấp nhất, chỉ khoảng 56%. Điều này cho thấy có thể tại Tân Châu đã xuất hiện dòng nấm mới để thích nghi với các biện pháp phòng trừ nấm bệnh tại đây. Do đó, cần phải nghiên cứu thêm về dòng nấm này để có thể đƣa ra biện pháp phòng trừ hữu hiệu hơn.
Nhƣ vậy, phân tích dữ liệu RAPD đã cho chúng ta thấy sự đa dạng di truyền của 17 dòng phân lập nấm R. solani trong khoá luận này. Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng và sơ đồ phân nhóm còn cho thấy mối quan hệ di truyền giữa các dòng nấm. Các dòng nấm đƣợc thu thập tại các vùng càng gần nhau thì càng có tƣơng quan di truyền càng gần nhau và ngƣợc lại, các dòng thu thập tại các tỉnh càng xa nhau thì
tƣơng quan di truyền càng xa nhau. Ngoài ra, các dòng nấm thu thập từ các vùng có điều kiện khí hậu càng khác nhau thì có sự tƣơng quan di truyền càng xa nhau.
Với phổ kí chủ rộng, nấm R. solani rất dễ dàng lây truyền bệnh cho các vùng đất nông nghiệp lân cận với vùng lúa đã bị bệnh. Các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc có đến 188 loại cây thuộc 32 họ là kí chủ của dòng nấm R. solani gây bệnh trên lúa. Khi điều kiện không thuận lợi cho sự sống và sinh sản, R. solani có thể tồn lƣu trong đất nhiều năm chờ điều kiện thuận lợi hoặc biến đổi để phù hợp với môi trƣờng sống mới. Chính sự biến đổi đa dạng này đã gây khó khăn rất lớn cho việc phòng và trị nấm. Do đó, cần phải nghiên cứu nhiều hơn về di truyền của dòng nấm này để có thể xây dựng một chiến luợc phòng và trị nấm thực sự hiệu quả và an toàn cho môi trƣờng.
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Li trích thành công DNA tổng số của 17 dòng phân lập nấm R. solani. - Xây dựng đƣợc qui trình RAPD khá tốt có thể dùng để phân tích sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani.
- Dự trên dữ liệu phản ứng RAPD với 3 primer OPL-05, OPL-08 và OPM- 13 trên 17 dòng phân lập nấm R. solani gây bệnh khô vằn lúa có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 53% - 89%.
5.2. Đề nghị
- Tăng số lƣợng mẫu và phạm vi lấy mẫu để có kết quả khái quát hơn. - Tăng số primer sử dụng trong phản ứng RAPD nhằm đạt đƣợc những kết quả chính xác hơn.
- Tiếp tục tối ƣu hoá phản ứng RAPD cho các dòng phân lập nấm R. solani.
Chƣơng 6
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử : Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
2. Đƣờng Hồng Dật, 1976. Sổ tay bệnh hại cây trồng tập 1. NXB Nông Thôn, Việt Nam.
3. Lê Văn Huy, 2006. Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm Corenespora cassiicola (Berk & Curt) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea Brasiliensis Muell. Arg.) tại trại thực nghiệm Lai Khê, Viện nghiên cứu cao su Việt Nam bằng kĩ thuật RAPD. Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
4. Nguyễn Thị Huệ, 2003. Khảo sát một số đặc tính và đánh giá sự đa dạng của các mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ một số cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam 5. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phƣơng pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh
học. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
6. Nguyễn Việt Long, 2001.Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm vằn trên lúa của hai chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani trên ruộng lúa nƣớc ở Đồng Tháp. Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
7. Nguyễn Đức Lƣợng, 2001. Công nghệ sinh học. NXB đại học quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
8. Nguyễn Đức Lƣợng và ctv., 2002. Công nghệ gen. NXB đại học quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
9. Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây Nông Nghiệp. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam
10.Nguyễn Minh Nguyệt, 2003. Khảo sát một số đặc tính của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ cây bông (Gossypium sp.) và cây bắp (Zea may L.). Luận văn tốt nghiệp ngành Nông học. Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam
11.Ou S. H., 1983. Bệnh hại lúa (Viện Bảo Vệ Thực Vật dịch). NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam.
12.Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005. Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
Tiếng Anh
13.Carling D.E. and Sumner D.R., 1992. Rhizoctonia spp 157-165. In: Singlton L., Mihail J.D. and Rush C.M. (eds), Methods for research on soilborne phyto- pathogenic fungi. APS Press, St. Paul, Minnesota.
14. Ducan S, Barton JE and O’Brien PA, 1993. Analysis of variation in isolates of
Rhizoctonia solani by random amplified polymorphic DNA assay. Mycologycal Research 97, 1075-1082
15. Fenille R. C., Ciampi M. B., Kuramae E. E., and Souza N. L., 2003. Identification of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by rDNA-ITS sequences. Fitopatol. bras. vol. 28.
16.Hsiang T. and Dean J. D., 2001. DNA sequencing for anastomosis grouping of
Rhizoctonia solani isolates from Poa annua. International turfgrass society 9: 674-678.
17.Hugh G.Griffin, 1994. PCR Technology current innovations. CRC Press, Boca Raton , Ann Arbor, London, Tokyo. 179-209.
18.Kunigana S., Natsuaki T., Takeuchi T., and Yokosawa R., 1997. Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in
Rhizoctonia solani. Curr. Genet. 32: 237 – 243.
19. Kurt W., Hilde N., Kirsten W. and Weiland M., 1995. DNA fingerprinting in plant and fungi. CRC Press. 322p.
20.Lee S.B., and Taylor J.W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995, DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo. p. 70-71.
21.Liu Z. L. và Sinclair J. B., 1992. Genetic diversity of Rhizoctonia solani
anastomosis group 2. Phytopathology 82: 778 – 787.
22.Liu Z. L. và Sinclair J. B., 1993. Differentiation of intraspecific groups within anastomosis group 1 of Rhizoctonia solani using ribosomal DNA internal transcribed spacer and isozyme comparisions. Canadian Journal of Plant Phathology 15: 272 – 280.
23.Matsumoto M., Furuya N., Takanami Y. and Matsuyama N., 1996. RFLP analysis of the PCR-amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani. Mycoscience 37: 351 – 356.
24.Mayee C.D., Monga D., Sharma T.R., Rathore S.S, 2004. Differentiation of isolates of cotton root rot pathogens Rhizoctonia solani and R. bataticola using pathogenicity and RAPD markers. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 135-139.
Wedsite
25. www.cabi.org 26.www.mard.gov.vn 27.www.ppd.gov.vn
28.http://library.uws.edu.au/adt-NUWS/uploads/approved/adt- NUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf 29.www. Cababstarctsplus.org/google/abstract.asp?AcNo=2004305722 30.http://www.doaj.org/doaj?func=abstract&id=44178&toc=y Chƣơng 7 PHỤ LỤC
Bảng 7.1. Bảng số liệu mã hoá sản phẩm RAPD trƣớc khi xử lí bằng phần mềm NTYSYS L31 L38 L50 L54 L55 L56 L58 L59 L61 L63 L64 L651 L66 L72 L75 L781 L79 OPM-13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 OPL-05 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 OPL-08 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0