Sử dụng kỹ thuật rapd khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm

Sử dụng kỹ thuật rapd khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Rhizotonia solani GÂY BỆNH KHÔ VẲN LÚA Nghành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ MINH THƢ Thành phố Hồ Chí Minh -2007- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH KHÔ VẰN LÚA GVHD: Sinh viên thực hiện: ThS.TỪ THỊ MỸ THUẬN NGUYỄN THỊ MINH THƢ Thành phố Hồ Chí Minh 8 - 2007 iii LỜI CẢM TẠ  Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho con bƣớc qua những khó khăn.  Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy - Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. ThS. Từ Thị Mỹ Thuận đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hƣớng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận. Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng nhƣ thời gian thực tập tốt nghiệp. Thành Phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 8 năm 2007. Nguyễn Thị Minh Thƣ iv TÓM TẮT Nguyễn Thị Minh Thƣ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa”. Bệnh khô vằn lúa gây ra bởi nấm R. solani đƣợc xem là bệnh gây ra nhiều thiệt hại rất nghiêm trọng trên lúa. Sự đa dạng di truyền cùng với phổ kí chủ rộng của nấm gây khó khăn cho việc lựa chọn các dòng kháng cũng nhƣ việc xây dựng các biện pháp phòng và trị nấm một cách hiệu quả và an toàn cho môi trƣờng. Khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm là một bƣớc cần thiết nhằm hiểu rõ hơn về di truyền của quần thể nấm và cung cấp thêm thông tin cho việc xây dựng phƣơng pháp phòng và trị nấm. 17 dòng phân lập nấm R. solani thu thập từ nhiều tỉnh khác nhau đƣợc li trích DNA và thực hiện phản ứng RAPD với 3 primer OPL-05, OPL-08, OPM-13. Phân tích dữ liệu phản ứng RAPD bằng phần mềm NTYSYSpc đã chia 17 dòng nấm thành 2 dòng lớn. Sơ đồ phân nhóm có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 53 – 89 % và cho thấy sự đa dạng di truyền của 17 dòng phân lập nấm R. solani. Thông tin của nghiên cứu này có thể dùng để tăng thêm sự hiểu biết về di truyền của các dòng nấm R. solani và làm cơ sở để xây dựng phƣơng pháp phòng và trị nấm một cách hiệu quả và an toàn cho môi trƣờng. v SUMMARY Nguyen Thi Minh Thu, Nong Lam university, Ho Chi Minh city, 8/2007. “Use RAPD analysis study genetic diversity of Rhizoctonia solani population pathogenic sheath blight in rice”. Sheath blight caused by R. solani is an important disease on rice. This disease is cause of serious damage in rice crop. Chosing assistant plant culture and building strategy against this fungi is very difficult because of genetic diversity of R. solani isolates. So, study genetic diversity is the fisrt step to know about this fungi. Therefore, 17 R. solani isolates were recognized from several diffirent provinces were extracted total DNA and realize RAPD reaction with three primer OPL-05, OPL-08, OPM-13. Analysis RAPD data by NTSYSpc software was divided 17 isolates place into two group. Rate genetic similarity of these analysis isolate was a range from 53 to 89% . Information of study could enhance knowledge about genetic of R. solani isolates and to basis to build a method against fungi effect and safe for environment. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa Trang tựa Lời cảm tạ . iii Tóm tắt iv Summary . v Mục lục . vi Danh sách các chữ viết tắt . ix Danh sách các hình . x Danh sách các bảng . xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU . 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài . 2 1.2.1. Mục tiêu . 2 1.2.2. Yêu cầu đề tài 2 1.3.Giới hạn của đề tài 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1.Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani . 3 2.1.1.Đặc điểm hình thái 3 2.1.2. Đặc điểm sinh lý 4 2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy . 5 2.1.4. Phạm vi kí chủ của nấm Rhizoctonia solani 5 2.1.5. Sự phân nhóm của nấm Rhizoctonia solani 6 2.2. Bệnh khô vằn hại lúa do nấm Rhizoctonia solani gây ra . 6 2.2.1. Triệu chứng bệnh . 7 2.2.2. Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh 7 vii 2.2.3. Phòng chống bệnh khô vằn . 8 2.3. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền 9 2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Retriction Fragment Length Polymorphism) . 9 2.3.2. Phƣơng pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism) 10 2.3.3. Microsatellite . 11 2.3.4. Phƣơng pháp RAPD (Random Amplification Polymorphism DNA) . 11 2.3.4.1. Giới thiệu kỹ thuật RAPD . 11 2.3.4.2. Một số vấn đề thƣờng gặp khi thực hiện phản ứng RAPD . 12 2.3.4.3. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD 13 2.3.4.4. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD . 13 2.3.4.5. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD . 13 2.3.4.6. Những cải tiến của kỹ thuật RAPD . 14 2.4. Các kết quả nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani. 14 2.4.1. Những nghiên cứu trong nƣớc . 14 2.4.2. Những nghiên cứu ở nƣớc ngoài. 15 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 3.1. Thời gian và địa điểm 16 3.2. Vật liệu nghiên cứu 16 3.2.1. Nguồn nấm 16 3.2.2. Những hoá chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 16 3.2.2.1. Những hóa chất sử dụng để li trích DNA 16 3.2.2.2. Những hoá chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD 16 3.2.2.3. Những hoá chất sử dụng để điện di sản phẩm RAPD . 18 3.2.3. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu . 18 3.2.3.1. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong li trích 18 3.2.3.2. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong phản ứng RAPD 18 3.2.3.2. Các dụng cụ và thiết bị dùng trong điện di 18 3.3. Phƣơng pháp tiến hành . 19 3.3.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani 19 viii 3.3.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 19 3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát số lƣợng chu kì phản ứng 20 3.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD . 21 3.3.3. Thực hiện phản ứng RAPD . 23 3.3.4. Điện di sản phẩm RAPD . 23 3.3.5. Phân tích kết quả RAPD 23 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1. Kết quả li trích DNA tổng số của nấm R. solani . 24 4.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 25 4.2.1. Lƣợng DNA mẫu . 25 4.2.2. Khảo sát chu kì phản ứng 26 4.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD 26 4.3. Phản ứng RAPD của các dòng phân lập nấm R. solani . 29 4.4. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani 32 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1. Kết luận . 37 5.2. Đề nghị 37 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHẦN 7: PHỤ LỤC 41 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified fragment length polymorphism PDA Potato dextrose agar R. solani Rhizoctonia solani RAPD Random amplification polymorphism DNA RFLP Retriction fragment length polymorphism SSR Simple sequense repeat VNTR Variable number tandem repeat x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Bệnh khô vằn trên cây lúa 6 Hình 4.1. Ảnh điện di DNA tổng số của các dòng phân lập nấm R. solani . 24 Hình 4.2. Ảnh điện di DNA của các dòng phân lập nấm R. solani sau khi pha loãng . 25 Hình 4.3.Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L651 với primer OPM-08 ở các số chu kì khác nhau của qui trình nhiệt 26 Hình 4.4.Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với các nồng độ MgCl2 và primer khác nhau 27 Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với các nồng độ DNA mẫu và Taq khác nhau 28 Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPM-13 . 29 Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPL-05 30 Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPL-08 30 Hình 4.9. Sơ đồ phân nhóm (dendrogram) của 17 dòng phân lập nấm R. solani dựa trên sản phẩm RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05, OPl-08 . 32 . [...]... lập nấm R solani Bƣớc đầu tiên để có thể hiểu đƣợc cấu trúc quần thể là cần phải hiểu về sự đa dạng di truyền của R solani bởi sự đa dạng di truyền phản ánh lịch sử tiến hoá và tiềm năng tiến hoá của quần thể Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử hiện nay, nhiều phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của các loài nấm bệnh nói chung và R solani nói riêng nhƣ RFLP, RAPD, ... hiện đề tài : “ Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa” 1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu Khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa, cung cấp thông tin để tăng thêm sự hiểu biết về di truyền của nấm R solani và làm cơ sở cho việc xây dựng các biện pháp phòng trừ nấm hiệu quả và... Khả năng nhận di n chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao (Nguyễn Thị Lang, 2002) 2.3.4.5 Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD 1.1.5 Kỹ thuật RAPD đƣợc phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhƣng vẫn còn đƣợc sử dụng do ƣu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD: Đánh giá đa dạng di truyền: đã đƣợc áp dụng trên các... nghiên cứu này đã sử dụng 8 primer Kết quả phản ứng RAPD đƣợc xử lí đã cho thấy hệ số di truyền của các dòng nấm này khoảng từ 0,35 -1 và hệ số di truyền trung bình của mỗi nguồn nấm là 0,67 Yang và ctv (1995) đã sử dụng phƣơng pháp RAPD để khảo sát sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Rhizoctonia solani từ nhiều nơi khác nhau nhƣ: Western Australia, Newdegate, Esperance Tất cả các dòng nấm đƣợc nghiên... phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang, 2002) Ngoài ra kỹ thuật RAPD còn đƣợc áp dụng xây dựng bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002) 1.1.6 2.3.4.6 Những cải tiến của kỹ thuật RAPD Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD đƣợc mô tả Kỹ thuật thứ nhất là sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer nhƣ kỹ thuật RAPD thông thƣờng Phƣơng pháp này có thể làm tăng hoặc... tế: chi phí thực hiện thấp Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá sự đa dạng di truyền và nhận di n chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao (Nguyễn Thị Lang, 2002) 2.3.4.4 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD 1.1.3 Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao và 1.1.4 không ổn định Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy... giá đa dạng di truyền Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lƣợc nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt đƣợc các chỉ thị đồng trội Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và ctv, 1995) 2.4 Các kết quả nghiên cứu về sự. .. về sự đa dạng di truyền của nấm R.solani 2.4.1.Nghiên cứu trong nƣớc Nguyễn Thị Nghiêm (1997) bằng phƣơng pháp đánh dấu phân tử với kỹ thuật PCR sử dụng hai primer chuyên biệt ERIC1 và ERIC2 đã chia 137 dòng nấm R solani Kühn thu thập ở đồng bằng sông Cửu Long thành 33 nhóm nấm mang tính đa dạng di truyền khác nhau.(dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) Nguyễn Thị Huệ (2003), dựa trên kỹ thuật RFLP của. .. ứng RAPD đƣợc sử dụng để khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm R solani 29 Bảng 4.2 Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng di truyền (%) giữa 17 dòng phân lập nấm R solani dựa trên sản phẩm RAPD với 3 primer OPL-05, OPL-08, OPM-13 33 Bảng 7.1 Số liệu mã hoá của sản phẩm phản ứng RAPD trƣớc khi xử lí bằng phần mềm NTSYS 41 xi 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Rhizoctonia solani Kühn là loài nấm. .. khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận di n những chỉ thị phân tử (marker) trội (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) Về cơ bản kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc: - Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR - Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid - Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA . 8/2007. Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa”. Bệnh khô vằn lúa gây ra bởi nấm. biện pháp quản lí nấm một cách hữu hiệu, chúng tôi thực hiện đề tài : “ Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizoctonia