Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự da dạng di truyền cây mầm trắng

Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự da dạng di truyền cây mầm trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHƢỚC DOANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 / 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******************* BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ NGUYỄN PHƢỚC DOANH Niên khóa: 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 / 2007 iii LỜI CẢM TẠ  Con muốn hôn lên đôi vầng trán đã nhiều nếp nhăn của Cha Mẹ để bày tỏ lòng yêu thƣơng của con với ngƣời. Suốt cuộc đời này con xin mãi khắc ghi công ơn sinh thành, dƣỡng dục của Cha Mẹ đã nuôi dƣỡng con khôn lớn và cho con ăn học nên ngƣời. Con rất muốn Cha Mẹ biết rằng con yêu Cha Mẹ nhiều lắm, con luôn tự hào vì là con của Cha Mẹ. Con xin chân thành biết ơn những ngƣời thân yêu trong gia đình đã luôn động viên và tạo điều kiện cho con ăn học đến ngày hôm nay. Em xin gởi lòng biết ơn đến:  Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Ban Chủ nhiệm và các Thầy, Cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học.  Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ, anh Bình, anh Kiệt thuộc phòng kỹ thuật. đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho phép em thực hiện đề tài này. Em xin đặc biệt gởi lòng biết ơn và tri ân sâu sắc đến Thầy - Tiến sỹ Bùi Minh Trí – giáo viên hƣớng dẫn, đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý giá trong nghiên cứu cũng nhƣ trong cuộc sống, giúp em hoàn thành đề tài này và ứng dụng nhiều trong thời gian tới. Và rất cảm ơn đến các anh chị đang công tác tại Trung tâm phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại học Nông Lâm: chị Hƣng, chị Dung, chị Liên, anh Khoa, anh Phƣơng, anh Vũ…cùng các bạn sinh viên Công nghệ sinh học K29 thƣơng yêu, đã cùng tôi chia sẽ nhiều buồn vui, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này. Xin chân thành cảm ơn ! NGUYỄN PHƢỚC DOANH iv TĨM TẮT KHĨA LUẬN NGUYỄN PHƢỚC DOANH, Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài “BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD” đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm và Hóa sinh trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007. Mắm trắng là lồi cây ngập mặn thực sự, giữ nhiều vai trò quan trọng và có sự phân bố rộng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Tuy nhiên, trải qua những hoạt động khai thác của con ngƣời, quần thể mắm trắng tại đây ngày càng thối hóa và suy giảm về diện tích nghiêm trọng. Vì vậy, những nghiên cứu về đa dạng di truyền trở nên cần thiết để cung cấp những thơng tin cơ bản cho việc thiết lập các chiến lƣợc tái tạo và phục hồi sự đa dạng sinh học của hệ sinh thái. Những kết quả đạt đƣợc:  Thu đƣợc 50 mẫu lá mắm trắng có tính chất đại diện cao cho quần thể.  Tối ƣu quy trình ly trích DNA, thu nhận DNA chất lƣợng cao đáp ứng các u cầu nghiên cứu Sinh học phân tử.  Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm trắng, sử dụng primer OPAC10. Với 14 mẫu DNA phân tích thu đƣợc tổng cộng 49 băng, trung bình là 3,5 băng cho mỗi mẫu. Có 6 băng đa hình ở các kích thƣớc 450 bp, 390 bp, 330 bp, 300 bp,100 bp, 50 bp và chỉ 1 băng đồng hình ở kích thƣớc 200bp.  Kết quả thực hiện phản ứng RAPD đƣợc xử lý trên mần mềm NTSYS thu đƣợc cây phân lồi của những cây đem phân tích. Cây phân lồi cho thấy chỉ số đồng dạng di truyền khá cao từ 0,55 – 1. Điều này cũng có nghĩa sự đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ở mức thấp do đó cần đặc biệt chú ý đến cơng tác bảo tồn, phục hồi đa dạng di truyền trên cây mắm trắng và đa dạng sinh học rừng Cần Giờ, đáp ứng mục tiêu phát triển bền vững rừng trong thời gian tới. v SUMMARY NGUYEN PHUOC DOANH, Nong Lam university. “PREMILINARY RESEACH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avicennia alba IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA USING RAPD”. This thesis was carried out at Chemical & Biological Analysis And Experiment Center, Nong Lam university from April to August 2007. Avicennia alba is an important true mangrove species because of it’s large distribution, especially in Can Gio Mangrove Biosphere Reserve Area. However, over – exploitation by human activities has induced to a steady decline and degraduation. Studies on population genetics are necessary to provide basic information for establishing the strategies for conserving and recovering biodeversity of the ecosystem. The obtained results were:  Fifty of Avicennia alba leaf samples were collected.  The genome DNA isolation protocol was improved to get high quality DNA.  The RAPD – PCR procedure was developed and optimized suitable for Avicennia alba using primer OPAC10. Totally 49 amplicons were generated with an average of 3,5 applicons per individual. There were only one isomorphic băng (200 bps) and six polymorphic băngs (50 bps, 100 bps, 300 bps, 330 bps, 390 bps, and 450 bps).  A phylogenic tree was drawn by using NTSYS sofware based on RAPD results. This phylogenic shown a high coefficient similarity from 0.55 to 1 in 14 analized samples. It suggested that the genetic diversity of Avicennia alba population is relatively poor. So, strategies for conserving and recovering their genetic diversity in Can Gio biodiversity is urgently needed. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN . iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC BẢNG . ix DANH SÁCH CÁC HÌNH . x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi Phần 1. GIỚI THIỆU 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục đích . 2 1.3. Yêu cầu . 2 1.4. Giới hạn của đề tài . 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ 3 2.1.1. Đặc điểm tự nhiên 3 2.1.2. Cấu trúc 6 2.1.3. Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ 7 2.1.4. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển 9 2.1.5. Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ 9 2.2. Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba) . 10 2.2.1. Vùng phân bố . 10 2.2.2. Hình thái học cây mắm trắng . 11 2.2.3. Giá trị kinh tế của cây mắm trắng 13 2.2.4. Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ . 13 2.2.5. Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng 14 vii 2.3. Khái niệm về đa dạng di truyền . 14 2.3.1. Đa dạng sinh học 14 2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học 14 2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học 15 2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái . 15 2.3.3.2. Đa dạng loài . 15 2.3.3.3. Đa dạng di truyền . 16 2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam 17 2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật . 18 2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) 19 2.5.1 Khái niệm 19 2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR 19 2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR 20 2.5.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR 21 2.5.5. Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR . 21 2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền 22 2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 22 2.6.2. Nhóm dựa trên PCR 23 2.6.2.1. SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) . 23 2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) 24 2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) . 25 2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 30 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM . 33 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành . 33 3.1.1. Thời gian tiến hành . 33 3.1.2. Địa điểm 33 3.2. Vật liệu nghiên cứu 33 3.2.1. Mẫu thực vật 33 viii 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm 34 3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA . 34 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA . 35 3.2.2.3. Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD 36 3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 36 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 37 3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA . 37 3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích 39 3.3.2.1. Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel 39 3.3.2.2. Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế 39 3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD . 40 3.3.4. Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1 . 42 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 43 4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ . 43 4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu 44 4.3. Kết quả quá trình ly trích DNA tổng số . 44 4.4. Kết quả quá trình thực hiện phản ứng RAPD 47 4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1 . 47 4.4.2. Kết quả thí nghiệm 2 . 50 4.5. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ 50 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 5.1. Kết luận 54 5.2. Đề nghị . 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 56 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 . 40 Bảng 3.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 . 40 Bảng 3.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 41 Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 . 41 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4 47 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ . 5 Hình 2.2. Cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. . 11 Hình 2.3. Lá và hoa cây mắm trắng. . 12 Hình 2.4. Trái mắm trắng. . 12 Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR. . 20 Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI 26 Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI. 26 Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP. 27 Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP. . 28 Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP . 29 Hình 2.11. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR 30 Hình 4.1. Sơ đồ vị trí lấy mẫu tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ . 43 Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2 45 Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3. 45 Hình 4.4. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích tối ƣu . 46 Hình 4.5. Kết quả ly trích theo quy trình 4 . 46 Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 . 48 Hình 4.7. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 . 48 Hình 4.8. Sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen (Avicennia officinalis) 49 Hình 4.9. Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 2 trên cây mắm trắng . 50 Hình 4.10. Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng . 51 Hình 4.11. Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích . 52 [...]... của cây mắm trắng Do đó mặc dù di n tích rừng và trữ lƣợng cây rất lớn nhƣng lại bị giảm sút nhanh chóng và ngày càng nghiêm trọng, mức độ đe dọa: bậc V [16] Do đó các nghiên cứu về đa dạng di truyền trên các cây rừng ngập mặn nói chung và cây mắm trắng nói riêng rất đƣợc chú trọng đầu tƣ và khuyến khích thực hiện 2.2.5 Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng Những nghiên cứu trên cây mắm trắng chủ... cơ bản cho các kế hoạch bảo vệ và sử dụng hợp lý tiềm năng cây mắm trắng Đáp ứng yêu cầu đó, đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, và dƣới sự hƣớng dẫn của Tiến sĩ Bùi Minh Trí, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: 2 “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP... đa dạng di truyền 2.3.1 Đa dạng sinh học Đa dạng sinh học là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002) Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gien chứa đựng trong các loài và. .. học và không giao phối đƣợc với nhau [8], [22] Qua đó, ta thấy những nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới đƣợc thu thập chƣa đƣợc biết đến tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết 2.3.3.3 Đa dạng di truyền Là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên sự khác biệt của các cá thể trong quần thể và nghiên cứu. .. phôi nhũ, chồi mầm mọc bên trong vỏ trƣớc khi trái rụng với 2 lá mầm xanh, dày, trục rễ mầm có nhiều lông trắng [17] Hình 2.4 Trái mắm trắng 13 Nơi sống: Mắm trắng là loại cây ƣa sáng, sinh trƣởng nhanh, thích nghi với nhiều loại đất (bùn, cát, sét) và các độ mặn của nƣớc (mặn, lợ, ngọt) Mắm trắng là loài cây cho chồi gốc, thƣờng trổ hoa vào đầu mùa mƣa (tháng 4 – 6 dƣơng lịch), cho trái vào cuối mùa... về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài thƣờng bị ảnh hƣởng bởi những tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối đƣợc với nhau tạo ra con lai hữu thụ Trong loài có thể bao gồm một hay nhiều quần thể Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gien khác nhau Sự đa dạng. .. Hiện nay đã xuất hiện nhiều sâu 10 bệnh hại cây rừng, nhƣ sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân đe dọa nghiêm trọng đến sự sinh trƣởng của cây rừng Thêm vào đó, việc mở con đƣờng Rừng Sác băng qua rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay càng làm tăng thêm mối đe dọa đến môi sinh và sinh thái rừng nghiêm trọng [21] Do đó, việc nghiên cứu đa dạng di truyền của các loài cây rừng có giá trị để làm tiền đề cho công... gian cùng với sự phát triển của rừng, di n tích mắm trắng đang ngày càng thu hẹp trƣớc sự khai thác, sử dụng không hợp lý và lâm vào tình trạng báo động bởi những dịch sâu bệnh tấn công trên vùng rộng Việc đánh giá tổng quát về quỹ gien và mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ là cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho các kế hoạch bảo vệ và sử dụng... 1.2 Mục đích  Tối ƣu hóa quy trình ly trích DNA và bƣớc đầu hoàn thiện quy trình thực hiện phản ứng RAPD thích hợp cho cây mắm trắng  Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng (Avicennia alba) tại khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ 1.3 Yêu cầu  Thu thập đƣợc nhiều mẫu đặc trƣng, mang tính đại di n cao cho quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần... lịch) Chỉ vài giờ sau khi trái rụng, cây mầm bên trong hút nƣớc lớn ra, làm vỡ lớp vỏ trái bao ngoài và phát triển thành cây mới Mắm trắng thƣờng chiếm những di n tích mới bồi ven biển, nơi có mực thủy triều lên xuống hàng ngày Nói chung "Ðất bùn có nƣớc triều lên xuống hàng ngày" là đất sinh trƣởng, phát triển thích hợp của loài cây gỗ này [15] 2.2.3 Giá trị kinh tế của cây mắm trắng Đặc điểm của cây mắm . thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài “BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ. Minh, và dƣới sự hƣớng dẫn của Tiến sĩ Bùi Minh Trí, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: 2 “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ