2.3.1. Đa dạng sinh học
Đa dạng sinh học là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002).
Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gien chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng” [8].
2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học
Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con ngƣời, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta [9].
Đa dạng sinh học là một trong những nguồn tài nguyên không thể thay thế đƣợc, là cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vƣợng và bền vững của loài ngƣời [22].
2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học 2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái 2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái
Đây là sự đa dạng bao trùm nhất của đa dạng sinh học.
Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều kiện nhất định và có mối quan hệ tƣơng hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi trƣờng.
Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh. Các nhân tố hữu sinh gồm có nhóm sinh vật tự dƣỡng – vật sản xuất sơ cấp (thực vật quang hợp), những sinh vật tiêu thụ sơ cấp (động vật ăn cỏ), những vật tiêu thụ thứ cấp (các động vật ăn thịt), và sinh vật phân hủy các chất hữu cơ giải phóng các chất vô cơ cung cấp trở lại cho thực vật.
Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau của các kiểu quần xã sinh vật. Quần xã này đƣợc tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với nhau và với các điều kiện sống (đất, nƣớc, khí hậu, địa hình).
Tóm lại, hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao. Điều kiện môi trƣờng càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đó càng đa dạng [9].
2.3.3.2. Đa dạng loài
Sự đa dạng loài bao gồm số loài có trên Trái đất. Sự đa dạng này đƣợc thể hiện bằng số lƣợng loài khác nhau cùng sống trong một vùng nhất định. Loài đƣợc xác định bởi một trong hai cách:
Phân loại theo cấu tạo hình thái của loài: xác định theo nhóm cá thể
có những hình thái, sinh lý hoặc hoá sinh đặc trƣng, khác biệt với các nhóm khác. Cách phân loại này thƣờng đƣợc các nhà phân loại học, sinh học vận dụng để định loại, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới.
Phân loại sinh học loài: là nhóm cá thể có khả năng giao phối với
này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hóa và khảo sát các mối quan hệ về gien [8].
Những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và định loại các loài trên thực tế thƣờng phức tạp hơn rất nhiều so với lý thuyết (Rojas, 1992; Stanley, 1992). Một loài có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt những sự khác nhau theo đặc điểm cấu tạo và hình thái. Ngƣợc lại, các phân loài đôi khi giống nhau đến mức tƣởng nhƣ chúng là các thành viên của cùng một loài. Trong thiên nhiên đôi khi cũng tồn tại các loài “đồng hình”, các loài này rất giống nhau về cấu tạo hình thái hay sinh lý nhƣng lại cách ly về mặt sinh học và không giao phối đƣợc với nhau [8], [22].
Qua đó, ta thấy những nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới đƣợc thu thập chƣa đƣợc biết đến tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết.
2.3.3.3. Đa dạng di truyền
Là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên sự khác biệt của các cá thể trong quần thể và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài.
Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài thƣờng bị ảnh hƣởng bởi những tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể. Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối đƣợc với nhau tạo ra con lai hữu thụ. Trong loài có thể bao gồm một hay nhiều quần thể.
Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gien khác nhau. Sự đa dạng về bộ gien này là do các cá thể có các gien khác nhau, dù chỉ là rất ít. Gien là đơn vị di truyền cùng với nhiễm sắc thể đặc trƣng cho những protein riêng biệt.
Những hình thái khác nhau của gien đƣợc thể hiện bằng những alen và những khác biệt do sự đột biến. Những alen khác nhau của một gien có thể ảnh hƣởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau.
Những sự khác biệt về gien trong di truyền học đƣợc tăng dần khi con cái nhận đầy đủ tổ hợp gien và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các
gien trong quá trình sinh sản. Các gien trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp mới đƣợc thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống nhất mới cho con cái.
Tổng các gien và alen trong một quẩn thể là vốn gien của quần thể và những tổ hợp của các alen mà mỗi cá thể có đƣợc gọi là kiểu di truyền (genotype). Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể đƣợc biểu hiện đặc trƣng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trƣờng nhất định.
Số lƣợng khác biệt nhau về gien trong một quần thể đƣợc xác định bởi số gien trong vốn gien đó, thƣờng mỗi gien có nhiều hơn một alen (các gien đa hình) và số các alen cho mỗi một gien đa hình. Sự tồn tại của các gien đa hình cho phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gien dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận đƣợc những alen khác nhau từ các gien của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gien cho phép các loài thích ứng đƣợc với sự thay đổi của môi trƣờng [9], [22].
2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam
Việt Nam là một trong mƣời nƣớc có hệ sinh thái phong phú nhất trên thế giới. Việt Nam có khoảng 10 % số loài sinh vật của thế giới. Song sự đa dạng này đang bị đe dọa vì môi trƣờng sống bị hủy hoại bởi tình hình tăng dân số, việc xây dựng đập nƣớc và đƣờng xá cũng nhƣ việc mở rộng các hoạt động công nghiệp. Tình trạng tăng dân số và đô thị hoá đang gây sức ép đối với năng lực bảo vệ môi trƣờng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mặc dù diện tích che phủ của rừng đã tăng lên, song mối quan tâm thực sự là vấn đề chất lƣợng. Một nửa số rừng nguyên sinh đã bị mất. Hiện có 700 loài sinh vật nằm trong danh sách các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Mức độ ô nhiễm thƣờng xuyên vƣợt quá mức độ cho phép, và riêng mức độ bụi ở các khu đô thị ít nhất cũng cao gấp đôi so với tiêu chuẩn tối đa. Vì vậy mà các loài sinh vật bị tiêu diệt dần và một số loài có nguy cơ tuyệt chủng, làm ảnh hƣởng xấu đến đa dạng sinh học [8].
2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật
DNA thực vật là nguyên liệu quan trọng trong những nghiên cứu đa dạng sinh học [6]. Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997). Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết thích hợp. Mục đích cuối cùng là để thu đƣợc DNA tinh khiết cho những phân tích tiếp theo [2], [12], [14].
Quy trình chiết tách gồm 3 bƣớc cơ bản sau:
Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân. Mô đƣợc nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl, CTAB) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này có tác dụng phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau (nucleic acid / protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform / nƣớc). Mẫu đƣợc lắc thật mạnh trong một dung dịch chloroform và phenol, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein mà không hòa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại.
Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc isopropanol còn dính lại trên mẫu.Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn.
2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.5.1. Khái niệm 2.5.1. Khái niệm
Kỹ thuật PCR đƣợc nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq DNA polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận từ DNA mẫu [8].
2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR
DNA mẫu:
Đƣợc ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tƣợng nghiên cứu bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau. DNA thực vật thƣờng đƣợc ly trích từ mô lá, DNA động vật đƣợc ly trích từ máu, lông, mô.
Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. Tuy nhiên để thu đƣợc kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết.
Số lƣợng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 10 – 50 ng DNA thuần khiết [1]. Nồng độ DNA có thể xác định đƣợc dựa vào chỉ số đo OD (mật độ quang) ở độ dài sóng 260 nm và 280 nm. Khi DNA tinh khiết, lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức :
DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n Trong đó:
OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100)
Primer (mồi):
Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR. Nếu primer đƣợc thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ đƣợc khuếch đại chính xác [2].
Cặp primer là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F – primer (mồi xuôi) và R – Primer (mồi ngƣợc).
dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP):
Gồm dATP, dCTP, dTTP, dGTP đƣợc sử dụng với nồng độ nhƣ nhau.
Dung dịch buffer:
Tạo môi trƣờng thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động.
Taq DNA polymerase:
Là một loại enzyme polymerase bền với nhiệt, cô lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nƣớc nóng, có vai trò kéo dài đoạn DNA cần khuếch đại.
Ion kim loại Mg++:
Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động.
2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR.
Nguyên lý kỹ thuật PCR Từ 30 – 40 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện qua 30 - 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bƣớc: biến tính DNA, bắt cặp, kéo dài [7].
Biến tính: Hai mạch của chuỗi xoắn kép đƣợc tách ra nhờ nhiệt độ cao (94 - 960 C).
Bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer liên kết vào các mạch của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung (nhiệt độ này phụ thuộc vào primer nhƣng thƣờng là 50 - 560 C).
Kéo dài: Kéo dài dây mới nhờ primer dƣới sự thực hiện của Taq DNA polymerase (720 C).
Sau 30 - 40 chu kỳ, tiếp tục ủ ở 4oC trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR.
2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR
Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp và trong nhiều lĩnh vực khác.
Trong nghiên cứu genomic: multiplex PCR.
Trong nghiên cứu y học: Phát hiện, chẩn đoán đƣợc nhiều loại bệnh do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng gây ra.
Trong nông nghiệp: Chọn lọc giống cây trồng nhờ chỉ thị DNA (MAS), kiểm tra kết quả chuyển gien [8].
2.5.5. Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR
Ưu điểm của kỹ thuật PCR
Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là có thể thực hiện. Độ nhạy rất cao.
Thao tác đơn giản.
Thời gian thực hiện nhanh.
Độ tinh sạch của mẫu không cần cao. Lƣợng mẫu cần ít.
Nhược điểm của kỹ thuật PCR [1], [7]
Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính.
Kích thƣớc của đoạn khuếch đại bị giới hạn. Phản ứng PCR chỉ cho kết quả tốt khi thực hiện với những đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 1,5 kb. Với những đoạn có kích thƣớc trên 3kb, phản ứng PCR tỏ ra vô hiệu.
Sự sao chép bởi Taq DNA polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (đến 10-4, nghĩa là cứ khoảng 10000 nucleotid thì enzyme có thể gắn sai một nucleotid)
2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền
Nguồn gốc tính đa dạng sinh học ở thực vật nói riêng và ở sinh vật nói chung nằm ở thứ tự các bộ ba trên phân tử DNA làm nên bộ máy di truyền của chúng. Hiếm có các cá thể trong cùng một loài hoặc cùng một giống có thứ tự các bộ ba trên DNA trong bộ gien giống hệt nhau. Việc xác định tính đa dạng sinh học cực kì quan trọng trong chọn giống vì các vật liệu di truyền dùng để lai tạo thƣờng đƣợc đòi hỏi có tính đa dạng càng lớn càng tốt [8].
Để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các cá thể, quần thể về căn bản ngƣời ta thƣờng dựa trên các chỉ thị DNA. Chỉ thị DNA có thể đƣợc chia làm hai nhóm:
Nhóm không dựa trên PCR (non PCR-based): RFLP
Nhóm dựa trên PCR (PCR-based): SSCP, SSR, RAPD, AFLP Các phƣơng pháp này đều sử dụng sản phẩm DNA đã đƣợc chiết tách, tinh sạch từ khâu ly trích.
2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Là phƣơng pháp dùng để so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn. Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy
các băng DNA hoàn toàn giống nhau về số lƣợng và kích thƣớc. Ngƣợc lại nếu có sự khác nhau về trình tự DNA (khác giống hoặc do đột biến) thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA.
Phƣơng pháp tiến hành: DNA sau khi tách chiết đƣợc phân cắt bằng một enzyme nhất định, rồi chạy điện di, lúc này các đoạn DNA tách riêng ra với nhau tùy theo kích thƣớc của nó chạy trên gel agarose. Những đoạn DNA này đƣợc chuyển từ gel sang một thể rắn (tấm lọc nitrocellulose hoặc màng lọc bằng nylon), nơi nó bị cố định. Sau giai đoạn trƣớc khi lai DNA, ngƣời ta cố định các vị trí trên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});