HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Đƣớc đôi hay đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) là cây có giá trị về kinh tế và môi trƣờng. Gỗ đƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi trong xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản. Than đƣớc cho nhiệt lƣợng cao và ít khói [13]. Vỏ có nhiều tanin đƣợc dùng trong công nghệ thuộc da, công nghệ dƣợc phẩm, kỹ nghệ in, nhuộm, làm keo dán. Rừng đƣớc sản sinh nhiều bã mùn làm nền tảng cho chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển, cửa sông. Các khu rừng đƣớc có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở và ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển. Mặt khác các khu rừng đƣớc là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm. [5] Trong chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập măn Cần Giờ đã bị hủy diệt hoàn toàn bởi hàng chục ngàn tấn bom đạn, hàng triệu lít hóa chất khai quang đã rải xuống gây thiệt hại vô cùng nghiêm trọng về tài nguyên và môi trƣờng sinh thái. Từ năm 1978, Thành phố tiến hành khôi phục lại hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ với hầu hết giống đƣớc đƣợc thu mua ở Năm Căn (Cà Mau). Qua 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là “Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ” vào ngày 21/01/2000 [5]. Trƣớc áp lực là khu dữ trữ sinh quyển thế giới cùng với những vai trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi trƣờng thì việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi là vô cùng cấp thiết. Trên cơ sở đó, các cơ quan chức năng sẽ có chiến lƣợc bảo vệ, quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ theo hƣớng đa dạng sinh học. Rừng đƣớc trồng thuần rất nhạy cảm và dễ bị tổn hại khi có những tác động bên ngoài. Mặt khác chúng ta cũng có thể tìm ra các chỉ thỉ phân tử nhằm rút ngắn thời gian cho quá trình chọn giống, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng, đảm bảo cho sự phát triển bền vững.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: VÕ CƠNG DANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS BÙI MINH TRÍ VÕ CƠNG DANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM TẠ Khơng ngơn từ nói hết tình u dành cho Ba Mẹ, ngƣời sẵn sàng hy sinh tất Cảm ơn anh em, ngƣời tạo động lực cho tiến lên Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy Cô trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt bốn năm học Ban chủ nhiệm Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Sinh học động viên, giúp đỡ em thời gian thực khóa luận Thầy Bùi Minh Trí tận tình dẫn em suốt q trình thực khóa luận Chị Hƣng, chị Dung, chi Trân, anh Thế, anh Phƣơng, anh Khoa anh chị Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trƣờng động viên, giúp đỡ em trình thực khóa luận Ban quản lý Rừng phịng hộ Cần Giờ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thu thập mẫu Anh Bình, anh Kiệt anh phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phịng hộ Cần Giờ tận tình giúp đỡ em trình thu thập mẫu Xin cảm ơn bạn lớp Công nghệ Sinh học 29 chia sẻ niềm vui, nỗi buồn suốt bốn năm đại học Chân thành cảm ơn! Võ Cơng Danh iii TĨM TẮT VÕ CƠNG DANH, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 “HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ có giá trị kinh tế mơi trƣờng Việc nghiên cứu đa dạng di truyền đƣớc đôi cấp thiết nhằm bảo vệ, quản lý phát triển khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ theo hƣớng đa dạng sinh học Những kết đạt đƣợc Thu thập đƣợc 40 mẫu đƣớc với đặc điểm hình thái khác Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu đƣớc Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ đƣớc Xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho đƣớc Kết thực phản ứng RAPD với primer OPAC10 10 mẫu kết thu đƣợc band đa hình chiếm tỷ lệ 83,3% band đồng hình chiếm tỷ lệ 16,7% Phân tích kết RAPD với phần mềm NTSYSpc cho kết nhƣ sau: mẫu đƣớc trồng năm có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – 1,00 Các mẫu đƣớc trồng năm 1978 năm 1980 có hệ số đồng dạng di truyền biến thiên khoảng 0,50 – 0,83 Các mẫu đƣớc nguồn gốc chỗ đƣợc trồng năm 1991 trồng năm 1996 có hệ số đồng dạng di truyền 0,50 Những đƣớc đôi nguồn giống chỗ nguồn giống Cà Mau có hệ số đồng dạng di truyền thấp từ 0,33 đến 0,67 iv SUMMARY VO CONG DANH, Nong Lam University Ho Chi Minh City, September 2007 “DEVELOP A METHOD TO ACEESS THE GENETIC DIVERSITY OF Rhizophora apiculata Blume IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE BY RAPD-PCR” Mangrove population (Rhizophora apiculata Blume) in Can Gio swamp forest eco-conservation area has a high economic and environmental value Researching the genetic diversity of this plant is necessary to preserve and develop this area in a sustainable way Obtained results were: Collected 40 samples of Rhizophora apiculata Found out the best conditions to preserve Rhizophora apiculata Completed DNA extraction protocol from Rhizophora apiculata Established RAPD protocol for Rhizophora apiculata We analysed 10 samples using RAPD with primer OPAC 10 and got polymorphic bands (100 – 600kb) and monomorphic band (170 kb) which made up 83,3 percents and 16,7 percents of bands Analyse RAPD data with NTSYSpc software showed following results: Rhizophora apiculata planted in 1978, 1980 had high similarity from 0,83 to 1,00 Compare R apiculata planted in 1978 with the one planted in 1980 showed a similarity from 0,50 to 0,83 The similarity of local R apiculata and the one planted in 1991 or in 1996 is 0,50 While the local R apiculata and the one from Camau plants had long distance from 0,33 to 0,67 v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ xi Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu, giới hạn đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Giới hạn đề tài Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.1 Giới thiệu khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.2 Cấu trúc khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.3 Vai trò khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2 Đặc điểm sinh vật học hình thái học đƣớc đôi 2.2.1 Hình thái học 2.2.2 Phân bố 2.2.3 Vai trò rừng đƣớc 2.3 Quy trình ly trích DNA thực vật 2.3.1 Đánh giá chất lƣợng DNA 11 vi 2.4 PCR (Polymerase chain reaction) 12 2.4.1 Khái niệm 12 2.4.2 Nguyên tắc 13 2.4.3 Ứng dụng 13 2.4.4 Ƣu nhƣợc điểm 13 2.5 Đa dạng di truyền 14 2.5.1 Khái niệm 14 2.5.2 Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền 14 2.6 Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) 15 2.6.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 16 2.6.2 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 17 2.6.3 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 18 2.6.4 Một số nghiên cứu thị phân tử đƣớc 21 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 22 3.1 Thời gian địa điểm thực 22 3.1.1 Thời gian thực 22 3.1.2 Địa điểm thực 22 3.2 Vật liệu thí nghiệm 22 3.1.2 Mẫu đƣớc đôi 22 3.2.2 Hố chất thí nghiệm 23 3.2.3 Trang thiết bị thí nghiệm 24 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.3.1 Bố trí thí nghiệm 25 3.3.2 Phƣơng pháp ly trích DNA 25 3.3.3 Kiểm tra kết ly trích 28 3.3.4 Kỹ thuật RAPD 30 vii 3.3.5 Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền phần mềm NTSYS 34 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết thu thập mẫu đƣớc khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 36 4.2 Bảo quản mẫu .36 4.3 Hoàn thiện quy trình ly trích DNA .37 4.4 Kết phản ứng RAPD – PCR 44 4.4.1 Thí nghiệm 44 4.4.2 Thí nghiệm 45 4.4.3 Thí nghiệm .45 4.4.4 Thí nghiệm 46 4.4.5 Thí nghiệm 47 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận .51 5.2 Đề nghị 51 TÀI LIÊU THAM KHẢO 53 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 53 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 54 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine bp: Base pair CTAB: Cetyltrimethyl Ammonium Bromide dNTP: Deoxynucleotide triphosphate DNA: Deoxyribonucleic acid EB: Extraction Buffer EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid ng: Nanogram OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease RAPD: Random Amplified Polymorphism of DNA SDS: Sodium Dodecyl Sulfate SIDA: Swedish Inernaional Devolopment cooperration Agency TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA TE: Tris EDTA Tm: Melting temperature UNESCO: United Nations Educational Scientific and Cultural Organization UBND: Ủy ban Nhân dân UV: Ultra Violet ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Hình 2.2 Nguyên tắc kỹ thuật RAPD 19 Hình 3.1 Lá, hoa, trái đƣớc đôi 23 Hình 4.1 Vị trí lấy mẫu đồ Cần Giờ 36 Hình 4.2 DNA tổng số mẫu đƣớc thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo quy trình ) 40 Hình 4.3 DNA tổng số mẫu đƣớc (Lá già non) thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo quy trình 3) 40 Hình 4.4 DNA tổng số 17 mẫu đƣớc thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 41 Hình 4.5 DNA tổng số pha lỗng 17 mẫu đƣớc thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 41 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 mẫu đƣớc thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 44 Hình 4.7 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ Mg2+ thí nghiệm 45 Hình 4.8 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer OPAC10 thí nghiệm 45 Hình 4.9 Sản phẩm PCR thử nghiệm primer OPAC10 VÀ OPA10 46 Hình 4.10 Sản phẩm PCR 10 mẫu đƣớc thí nghiệm 47 Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền 10 mẫu đƣớc thu thập khu dự trữ sinh ngập mặn Cần Giờ 48 x ... THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD? ?? Cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata. .. quan khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.1 Giới thiệu khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.2 Cấu trúc khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.3 Vai trò khu dự trữ sinh rừng. .. đề tài: “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD? ?? 1.2 Mục đích,