HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Cây mắm biển (Avicennia marina) là một trong những loài thực vật đặc trƣng sinh sống ở rừng ngập mặn đem lại giá trị kinh tế và môi trƣờng rất cao.Tuy nhiên, những thập niên trở lại đây loài mắm biển có dấu hiệu lụi tàn. Vì vậy việc xây dựng chiến lƣợc phát triển lâu dài đem lại hiệu quả kinh tế và môi trƣờng cao, vấn đề đánh giá tổng quát quỹ gene và mức độ đa dạng của quần thể mắm tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh đƣợc xem là một việc làm cấp thiết. Sau một thời gian thực tập ở Viện Nghiên cứu CNSH và CNMT, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, chúng tôi đã đạt đƣợc kết quả: - Thu thập đƣợc 52 mẫu lá mắm với những đặc điểm hình thái khác nhau. - Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu lá mắm. - Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ lá mắm, ly trích tốt 47/52 mẫu - Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm. Qua thử nghiệm trên ba primer: primer 1 và primer RAH8 và primer OPAC10 thì thấy primer OPAC10 cho sản phẩm thể hiện sự đa dạng về di truyền cao. - Kết quả chạy RAPD với primer 1 chỉ cho 1 band đồng hình kích thƣớc 400 bp cho cả ba loài mắm, giúp xác định đƣợc marker chỉ thị cho loài mắm (Avicenniaceae). - Kết quả chạy RAPD với primer OPAC10 cho trung bình 6 band/mẫu. Số lƣợng band/mẫu không cao nhƣng lại thể hiện rõ sự đa hình giữa các mẫu. Chúng

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2003 – 2007 SINH VIÊN THỰC HIỆN: LÊ ĐỨC TUÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS BÙI MINH TRÍ LÊ ĐỨC TN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn ba mẹ gia đình ni đến ngày khôn lớn cho ăn học thành tài Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy Cô trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học Ban chủ nhiệm Thầy Cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học động viên, giúp đỡ em thời gian thực khóa luận Thầy Bùi Minh Trí, tận tình dẫn em suốt q trình thực khóa luận Các anh chị Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh động viên, giúp đỡ em trình thực khóa luận Ban quản lý Rừng phịng hộ Cần Giờ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thu thập mẫu Anh Bình, anh Kiệt anh, chị phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phịng hộ Cần Giờ tận tình giúp đỡ em trình thu thập mẫu Xin cám ơn bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 chia sẻ niềm vui, nỗi buồn suốt năm đại học Xin chân thành cảm ơn! LÊ ĐỨC TUÂN iii TÓM TẮT LÊ ĐỨC TUÂN, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Hội đồng hƣớng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ Cây mắm biển (Avicennia marina) loài thực vật đặc trƣng sinh sống rừng ngập mặn đem lại giá trị kinh tế môi trƣờng cao.Tuy nhiên, thập niên trở lại loài mắm biển có dấu hiệu lụi tàn Vì việc xây dựng chiến lƣợc phát triển lâu dài đem lại hiệu kinh tế môi trƣờng cao, vấn đề đánh giá tổng quát quỹ gene mức độ đa dạng quần thể mắm khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh đƣợc xem việc làm cấp thiết Sau thời gian thực tập Viện Nghiên cứu CNSH CNMT, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, đạt đƣợc kết quả: - Thu thập đƣợc 52 mẫu mắm với đặc điểm hình thái khác - Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu mắm - Hồn thiện quy trình ly trích DNA từ mắm, ly trích tốt 47/52 mẫu - Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho mắm Qua thử nghiệm ba primer: primer primer RAH8 primer OPAC10 thấy primer OPAC10 cho sản phẩm thể đa dạng di truyền cao - Kết chạy RAPD với primer cho band đồng hình kích thƣớc 400 bp cho ba loài mắm, giúp xác định đƣợc marker thị cho loài mắm (Avicenniaceae) - Kết chạy RAPD với primer OPAC10 cho trung bình band/mẫu Số lƣợng band/mẫu không cao nhƣng lại thể rõ đa hình mẫu Chúng iv tơi thu đƣợc band đa hình chiếm tỷ lệ 90% band đồng hình chiếm tỷ lệ 10% Kết phân tích phần mềm NTSYS (Numercial Taxonomy System) phiên 2.1, mẫu mắm đƣợc khảo sát đƣợc chia làm nhóm với khoảng cách phân nhóm 0,40 Nhóm gồm mẫu: M8, M18, M25, M40 Các có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,67 – 1,00 v MỤC LỤC Chƣơng Trang Trang tựa ii Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách hình ix Dang sách bảng x Chƣơng LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Hạn chế đề tài Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số khái niệm đa dạng sinh học 2.1.1 Đa dạng sinh học 2.1.2 Đa dạng di truyền 2.1.3 Ý nghĩa việc nghiên cứu đa dạng di truyền 2.2 Giới thiệu khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2.1 Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2.2 Cấu trúc khu dự trữ rừng ngập măn Cần Giờ 2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.3 Cây mắm biển 11 vi 2.3.1 Hình thái học 11 2.3.2 Nơi sống sinh thái 12 2.3.3 Phân bố 12 2.3.2 Quy trình ly trích DNA thực vật 13 2.4.1 Định lƣợng DNA phƣơng pháp quang phổ 14 2.4.2 Định tính DNA ly trích phƣơng pháp điện di 15 2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền 16 2.5.1 Giới thiệu chung tính đa dạng di truyền thị phân tử 16 2.5.1.1 Chỉ thị hình thái 17 2.5.1.2 Chỉ thị isozyme 17 2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – thị DNA 18 2.5.2 Kỹ thuật PCR 18 2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 18 2.5.2.2 Quy trình chuẩn phản ứng PCR 19 2.5.2.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR 21 2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 22 2.5.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 22 2.5.4.1 Ƣu điểm kỹ thuật RAPD 25 2.5.4.2 Nhƣợc điểm kỹ thuật RAPD 25 2.5.4.3 Ứng dụng kỹ thuật RAPD 25 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 27 3.1 Thời gian địa điểm thực 27 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 27 3.1.2 Địa điểm thực 27 3.2 Vật liệu thí nghiệm 27 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 vii 3.3.1 Vật liệu dùng ly trích DNA 27 3.3.2 Quy trình ly trích DNA 31 3.3.3 Kiểm tra kết ly trích DNA 33 3.3.4 Thực kỹ thuật RAPD 34 3.3.4.1 Dụng cụ hóa chất dung kỹ thuật RAPD 34 3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm 35 3.4 Phân tích kết phần mềm NTSYS 38 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 4.1 Kết thu thập mẫu mắm rừng ngập mặn Cần Giờ 40 4.2 Bảo quản mẫu hồn thiện quy trình ly trích DNA 41 4.2.1 Bảo quản mẫu 41 4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích 41 4.3 Kết chạy RAPD 43 4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8 với chu kỳ nhiệt 43 4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer với chu kỳ Bảng 44 4.3.3 Thí nghiiệm 45 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 5.1.1 Kết luận 48 5.1.2 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 52 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair CNMT: Công Nghệ Môi Trƣờng CNSH: Công Nghệ Sinh Học DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxynucleotide triphosphate E: East EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid EtBt: Ethidium bromide N: North OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature TE: Tris EDTA TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA UNESCO: United Nations Educational Scientific, and Cultural Organization UV: Ultra Violet ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Bản đồ khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Hình 2.2: Cấu trúc cành, trái Mắm 11 Hình 2.3: Nguyên lý phản ứng PCR 21 Hình 2.4: Ngun lý phân tích thị RAPD nghiên cứu đa dạng di truyền 25 Hình 4.1: Trái mắm biển(A); Hoa(B) 41 Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu đồ Cần Giờ 42 Hình 4.3: Kết ly trích theo quy trình 44 Hình 4.4: Sản phẩm DNA ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) 44 Hình 4.5: Kết PCR thí nghiệm 45 Hình 4.6: Sản phẩm PCR thí nghiệm 46 Hình 4.7: Sản phẩm PCR thí nghiệm 47 Hình 4.8 : Cây phân nhóm số mắm biển khu dự trữ sinh rừng Cần Giờ 48 ... Minh Tháng 8/2007 “HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD? ?? Hội đồng hƣớng... mặn Cần Giờ 2.2.1 Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2.2 Cấu trúc khu dự trữ rừng ngập măn Cần Giờ 2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.3 Cây mắm biển. .. tơi thực đề tài “HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TRÊN QUẦN THỂ MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD? ?? 2 1.2 Mục đích,