ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Cây cao su là cây công nghiệp cây có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và góp phần cải thiện kinh tế, xã hội và môi trƣờng. Chính vì vậy, công tác cải tiến giống để phục vụ nhu cầu phát triển cây cao su là rất quan trọng. Tuy nhiên, sự giới hạn về nguồn gen ở các nƣớc châu Á đã gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao su. Để khắc phục trở ngại này hiện nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã đƣa nguồn gen cây cao su từ vùng bản địa Amazon vào các chƣơng trình lai tạo giống. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu biến lƣợng, đặc điểm di truyền của các con lai để tạo nguồn tƣ liệu giúp cải tiến chƣơng trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon. Những kết quả đạt đƣợc: - Kết quả thí nghiệm trên 2 primer cho quy trình phản ứng RAPD nhận thấy Primer A18 có 10 băng đa hình (chiếm 83,33%) trong tổng số 12 băng đƣợc khuếch đại, primer OPB12 có 11 băng đa hình (chiếm 91,67%) trong tổng số 12 băng đƣợc khuếch đại - Kết quả phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền dựa trên chỉ số DICE của 20 con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có giá trị từ 0,522 đến 0,976. Giá trị này cũng có nghĩa là khoảng cách di truyền giữa các con lai trong quần thể biến thiên từ 0,024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------- o0o ------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: PHẠM NGỌC CHINH Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ PHẠM NGỌC CHINH ThS. LẠI VĂN LÂM Khóa: 2003-2007 KS. TRẦN THANH Tháng 08/2007 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . TS. Bùi Minh Trí, ThS. Lại Văn Lâm và KS. Trần Thanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. KS. Vũ Thị Quỳnh Chi đã có những chỉ dẫn, động viên giúp tôi thực hiện tốt khóa luận này. ThS. Lê Mậu Túy/ Trưởng Bộ Môn Giống Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam cùng các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ Môn Giống/Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Những người bạn đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp. Và con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để con được như ngày hôm nay. iv TÓM TẮT PHẠM NGỌC CHINH, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 x RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD “ Giáo viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ ThS. LẠI VĂN LÂM KS. TRẦN THANH Cây cao su là cây công nghiệp cây có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và góp phần cải thiện kinh tế, xã hội và môi trƣờng. Chính vì vậy, công tác cải tiến giống để phục vụ nhu cầu phát triển cây cao su là rất quan trọng. Tuy nhiên, sự giới hạn về nguồn gen ở các nƣớc châu Á đã gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao su. Để khắc phục trở ngại này hiện nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã đƣa nguồn gen cây cao su từ vùng bản địa Amazon vào các chƣơng trình lai tạo giống. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu biến lƣợng, đặc điểm di truyền của các con lai để tạo nguồn tƣ liệu giúp cải tiến chƣơng trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon. Những kết quả đạt đƣợc: - Kết quả thí nghiệm trên 2 primer cho quy trình phản ứng RAPD nhận thấy Primer A18 có 10 băng đa hình (chiếm 83,33%) trong tổng số 12 băng đƣợc khuếch đại, primer OPB12 có 11 băng đa hình (chiếm 91,67%) trong tổng số 12 băng đƣợc khuếch đại - Kết quả phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền dựa trên chỉ số DICE của 20 con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có giá trị từ 0,522 đến 0,976. Giá trị này cũng có nghĩa là khoảng cách di truyền giữa các con lai trong quần thể biến thiên từ 0,024 v đến 0,478. Kết quả này cho thấy quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có biến lƣợng di truyền khá rộng. - Kết quả phân nhóm di truyền dựa trên dữ liệu RAPD cho thấy chƣa có mối liên hệ nào đƣợc phát hiện giữa các đặc tính nông học (sinh trƣởng hoặc sản lƣợng) và marker RAPD thông qua 2 primer A18 và OPB12. Qua kết quả trên, bƣớc đầu cho thấy marker RAPD đã phản ánh đƣợc biến lƣợng di truyền trong quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268. Kết quả đề tài góp phần tạo tƣ liệu nghiên cứu di truyền nhằm nhằm sử dụng hiệu quả nguồn di truyền Amazone vào chƣơng trình cải tiến giống cây cao su Hevea. vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ . iii TÓM TẮT . iv MỤC LỤC . vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT . ix DANH SÁCH CÁC BẢNG . x DANH SÁCH CÁC HÌNH . xi CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU . 1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.2 MỤC TIÊU – YÊU CẦU . 2 1.2.1 Mục tiêu . 2 1.2.2 Yêu cầu 2 1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU . 4 2.1.1 Nguồn gốc và phân bố tự nhiên . 4 2.1.2 Sự phân bố và sản xuất cao su trên thế giới 4 2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây cao su . 5 2.1.4 Một số đặc điểm di truyền của cây cao su . 8 2.1.5 Quá trình cải tiến giống cao su 9 2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ . 11 2.2.1 Chỉ thị hình thái . 11 2.2.2 Chỉ thị isozyme 11 vii 2.2.3 Chỉ thị DNA 12 2.2.3.1 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 12 2.2.3.2 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 12 2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites) . 13 2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) . 13 2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 13 2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) . 14 2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 14 2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU19 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 21 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU . 21 3.1.1 Vật liệu di truyền . 21 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm . 21 3.1.2.1 Hoá chất ly trích DNA 21 3.1.2.2 Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật RAPD . 21 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm . 22 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU . 22 3.2.1 Thời gian nghiên cứu . 22 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu . 22 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu và ly trích DNA . 22 3.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA mẫu 23 3.3.3 Phƣơng pháp khuếch đại DNA 24 3.3.4 Phƣơng pháp điện di sản phẩm DNA sau khi khuếch đại . 24 3.3.5 Phƣơng pháp phân tích kết quả . 24 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN . 25 4.1 LY TRÍCH DNA 25 viii 4.1.1 Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose . 25 4.1.2 Định lƣợng DNA mẫu bằng phƣơng pháp đo mật độ quang (Optical Density) 26 4.2 KHUẾCH ĐẠI DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD 26 4.3 ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE . 27 4.4 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH CỦA CÁC PRIMER . 29 4.5 ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CON LAI 29 4.6 PHÂN NHÓM DI TRUYỀN CÁC CON LAI . 34 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ . 37 5.1 KẾT LUẬN 37 5.2 ĐỀ NGHỊ . 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC . 43 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism bp: base pair Ctv: cộng tác viên DNA: Deoxyribonuleotide acid dNTP: 2’- dideoxynucleotide - 5’- triphosphate Kb: kilo base NTSYSpc: Numercial Taxonomy System OD: Optical density PCR: Polymerase Chain Reaction RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA SSR: Simple Sequence Repeat (microsatellite) STS: Sequence-Tagged Sites SSCP: Single – Strand Conformation Polymorphism Taq: Thermus aquaticus UPGMA: Unweighted pair group method using arithmetic average UV: Ultra violet VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam SALB: South American Leave Blight x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1: Tỷ lệ và nồng độ các hóa chất tham gia phản ứng RAPD . 27 Bảng 4.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD . 27 Bảng 4.3: Số băng DNA đƣợc khuếch đại ở các primer 29 Bảng 4.4: Số băng DNA đƣợc khuếch đại của các con lai nghiên cứu . 30 Bảng 4.5: Hệ số tƣơng đồng di truyền của các con lai nghiên cứu 31 Bảng 4.6: Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các con lai với mẹ (PB260) và bố (RO44/268) của chúng. 32 Bảng 4.7: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở bố và các con lai. . 33 Bảng 4.8: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở mẹ và các con lai 33 Bảng 4.9: Phân nhóm thành tích sinh trƣởng và sản lƣợng của các con lai . 35 . học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: PHẠM NGỌC CHINH Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ. THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ PHẠM NGỌC CHINH ThS. LẠI VĂN LÂM Khóa: 2003-2007 KS. TRẦN THANH Tháng 08/2007 iii LỜI