Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và ctv phát minh năm 1990 đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong số các ứng dụng của sinh học phân tử. Về thực chất đây là phƣơng pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của các tế bào (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000)
Kỹ thuật PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện,
tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán phát hiện mầm bệnh trên ngƣời, động vật, thực vật, thực phẩm…(Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000)
Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000).
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này đƣợc kéo dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gel. Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2000).
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ hình 2.1.
Hình 2.1: Mô tả phản ứng PCR.
- Bƣớc 1 (tách sợi đôi DNA, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, ở điều kiện này phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn, thƣờng là ở nhiệt độ 94 - 95 C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
- Bƣớc 2 (bắt cặp, annealation): trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
- Bƣớc 3 (kéo dài, elongation hay extension): dƣới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới đƣợc tạo thành từ mạch đƣợc kéo dài. Nhiệt độ phù hợp cho enzyme polymerase hoạt động là 72 C và thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tuỳ thuộc vào kích thƣớc của DNA cần khuếch đại và nồng độ Mg2+.
Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lƣợng DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 1012 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm đƣợc nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide, sau đó tiến hành quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312 nm).
Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả của phản ứng PCR bao gồm:
– DNA khuôn: DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch, nhƣng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại từ dịch DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thƣờng phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong chẩn đoán. Lƣợng DNA đƣợc dùng trong phản ứng PCR là một lƣợng cực nhỏ, khoảng 1 g, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm lƣợng DNA khuôn xuống còn 100 ng. Nếu lƣợng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không nhƣ mong muốn hay còn gọi là dƣơng tính giả hay sản phẩm tạp nhiễm. Khuôn DNA có thể đƣợc thu nhận từ các mẫu không đƣợc bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần
– Enzyme: Thông thƣờng, DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao. Enzyme thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay là Taq DNA
polymerase đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại enzyme chịu nhiệt khác nhau đã đƣợc phát hiện và đƣa ra thị trƣờng với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn nhƣ enzyme Tth polymerase từ Thermus
thermophilus, enzyme này hoạt động nhƣ một enzyme phiên mã ngƣợc thông qua
sự hình thành cDNA trong điều kiện RNA làm khuôn và ion Mn2+, nhƣng trong điều kiện DNA khuôn và ion Mg2+, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA.
– Primer và nhiệt độ lai: Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:
+ Trình tự primer đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngƣợc, không có cấu trúc dimer primer do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer.
+ Nhiệt độ nóng chảy của primer xuôi và primer ngƣợc không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng, tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần.
+ Các primer phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen.
+ Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và primer ngƣợc không đƣợc quá lớn, phản ứng PCR tối ƣu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb.
– Các thành phần khác trong phản ứng PCR:
+ Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ 200 M/ mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dƣơng tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.
+ Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ tối ƣu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thƣờng nồng độ tối ƣu này phải đƣợc xác định riêng cho từng phản ứng.
– Số lƣợng chu kỳ phản ứng: Số lƣợng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thƣờng không vƣợt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm vì những nguyên nhân nhƣ sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không bắt cặp với primer mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ còn tùy thuộc vào số lƣợng mẫu ban đầu.
– Thiết bị và dụng cụ dùng trong phản ứng PCR: Thiết bị cho phản ứng PCR nhƣ máy luân nhiệt (thermocycler) cần đáp ứng đƣợc yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc thoát hơi nƣớc trong quá trình phản ứng. Eppendorf sử dụng trong phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000).