BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

TRUONG THI MINH THUY, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, September 2007. “PREMILINARY RESEARCH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Rhizophora mucronata Lamk. IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA BY RAPD”. The thesis was carried out in Chemical and Biological Analysis and Experiment Center at Nong Lam University from May to August in 2007. Supervisor: BUI MINH TRI, PhD. Mangrove is an ecological term referring to a taxonomical diverse assemblage of trees, including Rhizophora mucronata Lamk., that forms the dominant plant communities in tidal, saline wetlands along sheltered tropical and subtropical coast. Although the economic and environmental significance of mangroves is being increasingly recognized, it is in fact, decreasing around the world because of pollution and deforestation of the mangrove forests. By those reason, it is necessary to set up an integrated plan improving the ecosystem in order to establish a sustainable development for the mangrove forest in general and Can Gio Biosphere reserve are in particular. This research was aimed to set up appropriate protocols for evaluating genetic diversity of Rhizophora mucronata in Can Gio mangrove forest. The obtained results were:  Set up suitable protocol for extracting genomic DNA of fresh leaves of R. mucronata.  Optimize RAPD analysis protocol for R. mucronata. It was indicated that Primer OPAC10 gave highest polymorphic level among tested primers. From 14 samples, primer OPAC10 amplified at 18 loci, those included 2 monomorphic bands (with molecular weight: 300 bps & 400 bps) and 13 polymorphic bands.  Analysing with NTSYS 2.1, similarity between the natural R. mucronata and cultivated R. mucronata populations was in a range from 46 to 79 %. Another

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ MINH THÙY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ********************** BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ MINH THÙY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM ƠN Con thành kính ghi ơn Ba Mẹ sinh ni nấng thành ngƣời Con xin cảm ơn gia đình tất Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy, Cơ trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học Ban chủ nhiệm Thầy Cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học động viên, giúp đỡ em thời gian học tập thực khóa luận Thầy TS Bùi Minh Trí tận tình dẫn em suốt trình thực khóa luận Các anh chị Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh động viên, giúp đỡ em q trình thực khóa luận Ban quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thu thập mẫu Anh Bình, anh Kiệt anh chị phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ tận tình giúp đỡ em trình thu thập mẫu Các bạn thực đề tài hỗ trợ, giúp đỡ suốt q trình thực khố luận Xin cảm ơn tất bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 chia sẻ bao niềm vui, nỗi buồn suốt năm đại học Đặc biệt cảm ơn tất bạn phòng ủng hộ tinh thần đồng hành với suốt thời gian học tập Chúc ngƣời hạnh phúc thành đạt Xin chân thành cảm ơn! Trƣơng Thị Minh Thùy ii TĨM TẮT TRƢƠNG THỊ MINH THÙY, Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, 9/2007 “BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Giáo viên hƣớng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ Khóa luận đƣợc tiến hành Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh từ / / 2007 đến 31 / / 2007 Rừng ngập mặn hệ sinh thái gồm nhiều lồi khác nhau, có Đƣng Rhizophora mucronata Lamk., loài chiếm số lƣợng lớn vùng nƣớc mặn, đồng thời quần thể Đƣng hàng rào bảo vệ bờ biển quốc gia nhiệt đới cận nhiệt đới Tuy ý nghĩa kinh tế môi trƣờng rừng ngập mặn ngày đƣợc cơng nhận, song diện tích chúng khắp giới giảm dần theo thời gian ô nhiễm nạn phá rừng Trên sở đó, cần có kế hoạch hợp tác nhằm cải thiện hệ sinh thái, thiết lập phát triển bền vững cho rừng ngập mặn nói chung khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng Khóa luận nhằm mục đích thiết lập quy trình thích hợp cho việc đánh giá đa dạng di truyền Đƣng Rhizophora mucronata rừng ngập mặn Cần Giờ Kết đạt đƣợc:  Hồn thiện quy trình ly trích DNA từ mẫu Đƣng tƣơi  Xây dựng đƣợc quy trình phản ứng RAPD Đƣng Xác định đƣợc OPAC10 mồi tạo độ đa hình cao số mồi tiến hành khảo sát Từ 14 mẫu, OPAC10 khuếch đại 18 locus, có band đồng hình (trọng lƣợng phân tử: 300 bp 400 bp) 13 band đa hình  Kết phân tích phần mềm NTSYS 2.1, hệ số đồng dạng di truyền cá thể quần thể Đƣng tự nhiên Đƣng đƣợc trồng biến thiên từ 46 đến 79 % Kết phân tích 14 mẫu ngẫu nhiên khác, nhận thấy hệ số đồng dạng di truyền dao động từ 68 đến 100 % Điều cho thấy cá thể iii quần thể Đƣng khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ có mối quan hệ di truyền tƣơng đối gần, nhiên chúng lại phân bố rải rác khắp tiểu khu cá thể thể đƣợc tính đa dạng sinh học cao Tp HCM, ngày tháng năm 2007 Trƣơng Thị Minh Thùy iv ABSTRACT TRUONG THI MINH THUY, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, September 2007 “PREMILINARY RESEARCH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Rhizophora mucronata Lamk IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA BY RAPD” The thesis was carried out in Chemical and Biological Analysis and Experiment Center at Nong Lam University from May to August in 2007 Supervisor: BUI MINH TRI, PhD Mangrove is an ecological term referring to a taxonomical diverse assemblage of trees, including Rhizophora mucronata Lamk., that forms the dominant plant communities in tidal, saline wetlands along sheltered tropical and subtropical coast Although the economic and environmental significance of mangroves is being increasingly recognized, it is in fact, decreasing around the world because of pollution and deforestation of the mangrove forests By those reason, it is necessary to set up an integrated plan improving the ecosystem in order to establish a sustainable development for the mangrove forest in general and Can Gio Biosphere reserve are in particular This research was aimed to set up appropriate protocols for evaluating genetic diversity of Rhizophora mucronata in Can Gio mangrove forest The obtained results were:  Set up suitable protocol for extracting genomic DNA of fresh leaves of R mucronata  Optimize RAPD analysis protocol for R mucronata It was indicated that Primer OPAC10 gave highest polymorphic level among tested primers From 14 samples, primer OPAC10 amplified at 18 loci, those included monomorphic bands (with molecular weight: 300 bps & 400 bps) and 13 polymorphic bands  Analysing with NTSYS 2.1, similarity between the natural R mucronata and cultivated R mucronata populations was in a range from 46 to 79 % Another v analysis on 14 randomized samples, we obtained similarity ranged from 68 to 100% The result also suggested that R mucronata at Can Gio biosphere reserve area have not had closed relation but scattered in to various groups vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa i Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Abstract vi Mục lục viii Danh sách chữ viết tắt xii Danh sách bảng xiii Danh sách hình xiv Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 1.4 Giới hạn đề tài Chƣơng 2.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh 2.1.1 Khái niệm chức khu dự trữ sinh 2.1.2 Tổng quan khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.2.1 Điều kiện tự nhiên 2.1.2.2 Chức vùng khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh 2.1.2.3 2.1.3 2.2 Hệ sinh vật rừng ngập mặn Cần Giờ Thực trạng rừng ngập mặn Cần Giờ Cây Đƣng (Rhizophora mucronata Lamk.) vii 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Hình thái học 10 2.2.3 Phân bố 11 2.2.4 Giá trị kinh tế 11 2.3 DNA (Deoxyribonucleic acid) 12 2.3.1 Quy trình ly trích DNA thực vật 13 2.3.2 Các phƣơng pháp định lƣợng, định tính DNA 14 2.3.2.1 2.3.2.2 2.4 Định lƣợng DNA phƣơng pháp quang phổ 14 Định tính DNA phƣơng pháp điện di 15 Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme) 16 2.4.1 Các loại enzyme giới hạn 16 2.4.2 Trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn 16 2.4.3 Sử dụng enzyme cắt giới hạn phân tích DNA 16 2.5 PCR (Polymerase Chain Reaction) 18 2.5.1 Khái niệm 18 2.5.2 Nguyên tắc phản ứng PCR 18 2.5.3 Quy trình phản ứng PCR 19 2.6 Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) tầm quan trọng 20 2.7 Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) 21 2.8 Ý nghĩa việc nghiên cứu đa dạng di truyền 21 2.9 Một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền phát thị phân tử 22 2.9.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) 22 2.9.1.1 Khái niệm 22 2.9.1.2 Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa kỹ thuật RFLP 23 2.9.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) 24 2.9.2.1 Khái niệm 24 2.9.2.2 Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa kỹ thuật AFLP 26 2.9.3 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 27 2.9.3.1 Khái niệm 27 viii 2.9.3.2 Những ƣu điểm kỹ thuật RAPD 29 2.9.3.3 Những hạn chế kỹ thuật RAPD 29 2.9.3.4 Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa kỹ thuật RAPD 29 2.9.4 So sánh số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền phát thị phân tử 30 Chƣơng 3.1 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 31 Thời gian địa điểm thực 31 3.1.1 Thời gian thực 31 3.1.2 Địa điểm thực 31 3.2 Vật liệu thí nghiệm 31 3.2.1 Nguyên tắc thu thập mẫu 31 3.2.2 Cách ký hiệu mẫu 31 3.2.3 Cách lấy mẫu 32 3.2.4 Cách bảo quản mẫu 32 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 32 3.3.1 Quy trình ly trích DNA 32 3.3.1.1 Vật liệu dùng ly trích DNA 32 3.3.1.2 Quy trình ly trích DNA 33 3.3.1.3 Kiểm tra kết ly trích DNA phƣơng pháp quang phổ 35 3.3.1.4 Kiểm tra kết ly trích DNA phƣơng pháp điện di gel agarose 35 3.3.2 Kỹ thuật RAPD 35 3.3.2.1 Vật liệu dùng RAPD 35 3.3.2.2 Tiến hành thí nghiệm 37 Chƣơng 4.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 Kết thu thập mẫu Đƣng khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 42 4.2 Bảo quản mẫu 43 4.3 Kết OD (Optical Density) 44 ix 62 5.2 Đề nghị  Tiếp tục sử dụng primer OPAC10 với việc thử nghiệm thêm primer mới, để đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng với số lƣợng mẫu lớn rải rộng khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ  Thu thập Đƣng có đặc điểm hình thái đặc biệt (về hình dạng lá, hoa, màu sắc hoa, trái) nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng xác Đặc biệt nên thu thập mẫu Đƣng nằm sâu rừng để đạt đƣợc kết thật tổng quát quần thể Đƣng có rừng ngập mặn Cần Giờ  Tách band 300 bp, 400 bp để giải trình tự phục vụ cho việc phân biệt lồi Đƣng (Rhizophora mucranta Lamk.) với loài khác thuộc họ đƣớc (Rhizophoraceae) Đặc biệt band 300 bp, hầu hết sản phẩm RAPD Đƣng tạo band  Phải có biện pháp thúc đẩy nghiên cứu làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng, phong phú nguồn gene đảm bảo cho phát triển bền vững khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ vùng phụ cận  Hiện nay, quần thể đƣớc đến giai đoạn già, sâu bệnh gây hại mức báo động Để khắc phục khả đƣớc khu vực có mối quan hệ di truyền gần, tạo điều kiện cho mầm bệnh dễ lây lan thiếu đa dạng sinh thái khu vực đó, tiến hành kỹ thuật lâm sinh trồng xen Đƣng với đƣớc nhằm đạt đƣợc đa dạng cao, mang lại hiệu tốt việc ngăn chặn sâu bệnh hình thành hệ sinh thái ổn định 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Quỳnh Anh, 2005 Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Anacardium occidental L.) tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu kỹ thuật RAPD AFLP Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh Đỗ Ngun Ban, 2000 Nghề Lâm Sinh Nhà xuất Giáo dục Phạm Văn Bình, 2005 Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Acanardium occidentale L.) trồng tỉnh Ninh Thuận kỹ thuật RAPD AFLP Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục Phạm Thành Hổ, 1998 Di truyền học Nhà xuất Giáo dục TP Hồ Chí Minh Phạm Thành Hổ, 2006 Bài giảng Một số thị phân tử ứng dụng công tác giống trồng Lê Văn Khôi, Viên Ngọc Nam, Lê Đức Tuấn, 2006 Khôi phục phát triển bền vững hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh (1978 – 2000) Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh học phân tử - Giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh 11 Lê Đình Lƣơng, 2001 Ngun lý kỹ thuật di truyền Nhà xuất khoa học kỹ thuật 12 Trần Đình Nghĩa (chủ biên), 2005 Sổ tay thực tập thiên nhiên Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 64 13 Phạm Bình Quyền, 2002 Đa dạng sinh học Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội TIẾNG ANH 14 Desmond S.T Nicholl, 1994 An introduction to genetic engineering University of Paisley 15 Gene Namkoong and Dr Mathew P Koshy, 2001 Application of Genetic Markers to Forest tree species 16 Ulrich G Mueller and L LaReesa Wolfenbarger, 1999 AFLP genotyping and fingerpringting TRANG WEB 17 http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn/default.aspx?param=201AaWQ9MzE wNzYmZ3JvdXBpZD0ma2luZD1leGFjdCZrZXl3b3JkPUMlZTElYmElYTZO K0dJJWUxJWJiJTlj&page=1 18 http://homepages.vub.ac.be/~dagillik/mangrove/c_tagal.htm 19 http://images.google.com.vn/imgres?imgurl=http://avery.rutgers.edu/WSSP/ StudentScholars/project/archives/onions/rapd1.gif 20 http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif 21 http://vietnamnet.vn/khoahoc/moitruong/2004/07/176924/ 22 http://vietnamnet.vn/khoahoc/moitruong/2005/12/523907/ 23 http://www.agriviet.com/news_detail791-c46-s0-p0Mo_hinh_san_xuat_giong_va_nuoi_ca_bong_tuong_cong_nghiep.html 24 http://www.appliedbiosystems.com 25 http://www.bioteach.ubc.ca/quarterly/ 26 http://www.dbag.unifi.it/mangroves/human/uses1.htm#2 27 http://www.diendandulich.net/dulich/diendan/index.php?showtopic=1243&st=40 65 28 http://www.diendandulich.net/dulich/diendan/index.php?showtopic=1243&st=2 0&p=5154&#entry5154 29 http://www.hcmussh.edu.vn/USSH/ImportFile/Magazine/Journal141006114054 doc 30 http://www.hochiminhcity.gov.vn/home/left/gioi_thieu/gioi_thieu_chung/tong_qu an/xa_hoi/dia_ly_thu_muc/ba_he_sinh_thai_rung?left_menu=1 31 http://www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Rhizophora_mucronat.html# Description 32 http://www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Rhizophora_mucronat.html# Energy 33 http://www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Rhizophora_mucronata.html #Chemistry 34 http://www.indian-cean.org/bioinformatics/mangrove/mangcd/Rhizo5.htm 35 http://www.indian-ocean.org/mangcd.systam/sys.htm 36 http://www.iowalivingroadway.com/ResearchProjects/images/409b.gif 37 http://www.mangrovecentre.or.id/Gallery/flora_flora_14.jpg&usg 38 http://www.mangrovecrabs.com 39 http://www.sggp.org.vn/moitruongdothi/nam2004/thang7/8510/ 40 http://www.tchdkh.org.vn/tchitiet.asp?code=1924 41 http://www.vacne.org.vn/CD_ROM/root/data/HTML/ChuongIV-5.html 42 http://www.vacne.org.vn/CD_ROM/root/data/HTML/ChuongIV-6.html 43 http://www.vacne.org.vn/CD_ROM/root/data/tomtatvn_RUNG.html 44 http://www.vacne.org.vn/Gioi%20thieu/gioithieu.htm 45 http://www.vacne.org.vn/Thongtin_Hoatdong/TinHoiQ4_06.htm#Sinh%20Quyen 66 46 http://www.vncreatures.net/tracuu.php?loai=2 47 http://www.worldagroforestrycentre.org/sea/products/afdbases/asp/ 48 http://www/math.mit.edu/~lippert/18.417/lectures/02_PartialDigest/ 49 www.nea.gov.vn/thongtinmt/noidung/hd_so10_05.htm 50 www.nea.gov.vn/thongtinmt/noidung/sg_4_4_05.htm 51 www.saigon-tourist.com/vn/khudulich/vamsat.htm 52 www.vnn.vn/khoahoc/moitruong/2005/03/394535/ -1- PHỤ LỤC 1: Đặc điểm Đƣng đƣợc thu thập rừng ngập mặn Cần Giờ STT TÊN MẪU 11.1 11.2 TIỂU TỌA ĐỘ ĐỊA LÝ KHU 48P UTM 11 Tự nhiên 11 h= m, d = cm 0705980 1160966 Cây xanh tốt, có nhánh lớn, trái dài Tự nhiên 11.3 11 11.4 11 11.5 GHI CHÚ h = m, d = - cm Cây có nhiều nhánh 0706116 1160712 nhỏ, có nhiều hoa, trái nhỏ ĐẶC ĐIỂM h = m, d = cm 0706034 1161073 Cây xanh tốt, có nụ hoa, trái h = m, d = cm 0706623 1161423 Cây có hoa, trái, có nhiều sâu Tự nhiên Tự nhiên 11 h= m, d = cm Cây có nhiều vàng, 0706795 1161474 sâu, già, khơng hoa, khơng trái Tự nhiên Tự nhiên 11.6 11 h = m, d = cm Cây có nhánh, 0706252 1161267 già, không hoa, không trái 11.7 11 0704683 1160909 12.8 12 h = m, d = cm Cây xanh tốt, to h = m, d = cm 0706176 1161331 Cây tốt, không hoa, khơng trái 7.9 Cây ngập triều, cịn 0711211 1165828 nhỏ tuổi, không hoa, không trái 10 7.10 Cây ngập triều, cịn 0711348 1166061 nhỏ tuổi, khơng hoa, không trái Tái sinh Tự nhiên Trồng Trồng -2- 7.11 h = 2,5 m, d = cm 0711394 1166150 Cây có nhánh, xanh tốt, trái nhỏ, hoa 12 7.12 h = 2,5 m, d = cm 0711395 1166151 Cây xanh tốt, không hoa, không trái 13 7.13 0711427 1166225 14 2B.14 2B 0714899 1168188 15 2B.15 2B 0713958 1169946 16 2B.16 2B 0713738 1170168 17 2B.17 2B 0712242 1170840 18 2B.18 2B 0712082 1170712 19 2B.19 2B 0711195 1170519 20 1.20 0711030 1170481 21 2B.21 2B 0710388 1170284 22 2B.22 2B 0710667 1170125 23 1B.23 1B 0710061 1170096 24 1.24 0709658 1170361 25 2B.25 2B 0710202 1169668 h = 1,5 m, d = cm Lá xanh đậm, già Tự nhiên 26 2B.26 2B 0710689 1168900 h = m, d = cm Cây non, xanh Tự nhiên 11 Cây ngập triều, xanh tốt Cây ngập triều, xanh tốt, non h = 1,5 m, d = cm Cây xanh tốt h= m, d = 1,5 cm Cây có nhiều vàng h = m, d = 1,5 cm Cây có nhiều vàng h = m, d = 1,5 cm Cây có nhiều già h < 1m, d = cm Cây có vàng h = m, d = cm Cây nhỏ, nhánh nhỏ, già h = 3m, d= cm Cây to có nhiều h = m, d = 1,5 cm Cây tốt, già h = m, d = cm Cây xanh tốt h = 2,5 m, d = cm Cây xanh tốt Tự nhiên Tự nhiên Trồng Trồng Trồng Trồng Trồng Tự nhiên Tự nhiên Tự nhiên Tự nhiên Tự nhiên Tự nhiên Tự nhiên -3- h = m, d = 8-10 cm Cây xanh tốt, có nhiều hoa, nhiều trái, trái dài 20 cm h = m, d = 11 cm Cây có hoa, trái dài 20 -25 cm 27 27 10 N 10° 30' 05.1" E °106 52' 05.0" 28 28 10 N 10°/ 30'/ 04.6'' E 106° 52' 04.6" 10 N 10° 30' 07.1" E 106° 52' 59.5" h = 1m, d = 1,5 cm Cây có nhiều sâu, to Tái sinh Trồng 29 30 31 29 Tự nhiên Trồng 30 10 N 10° 30' 07.3" E 106° 52' 03.3" h = m, d =15 cm Cây xanh tốt, to, có nhiều hoa, trái dài 30 cm 31 10 N 10° 30' 06.2" E 106° 52' 10.0" h = 6m, d = 10 cm Cây có nhiều hoa, nhiều trái Tự nhiên h = 0,8 m, d = cm Cây ngập triều có nhiều sâu Tái sinh 32 32 10 N 10° 30' 07.2" E 106° 52' 59.8" 33 33 10 N 10° 30' 05.2" E106° 52' 04.5" h = m, d = cm Cây có nhiều sâu Trồng 34 34 10 N 10° 30' 05.5" E 106° 52' 04.1" Cây ngập triều, nhỏ Tự nhiên 35 35 10 N 10° 30' 05.3" E 106° 52' 04.0" Cây ngập triều, nhỏ Tự nhiên 36 36 10 N 10° 30' 04.9" E 106° 52' 04.8" h = 5m, d = cm Cây xanh tốt, to Trồng -4- PHỤ LỤC 2: Cơng dụng cách pha hóa chất ly trích HĨA CHẤT CƠNG DỤNG CÁCH PHA CTAB (C19H42NBr, M = 364,46 g / mol) Phá vỡ màng tế bào, Hòa tan nƣớc cất lần màng nhân 65oC Ethanol 100% Tủa DNA nồng độ Dung dịch gốc muối Sodium acetate cao nhiệt độ thấp Rửa DNA Pha với tỷ lệ thể tích ethanol 100% thể tích nƣớc cất lần hấp tiệt trùng Tủa DNA nhiệt độ Dung dịch gốc thấp, khơng cần muối Sodium Acetate Biến tính protein Dung dịch gốc sắc tố có mẫu Tách lớp sau ly tâm Ethanol 70% Iso Propanol Chloroform Iso Amylalcohol (C5 H10O, M = 88,75 g / mol) Tránh tạo bọt Dung dịch gốc trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein Pha với tỷ lệ 24 thể tích sắc tố mẫu Tách Chloroform thể tích lớp sau ly tâm, DNA Isoamyl Alcohol đƣợc phóng thích nằm pha nƣớc lớp EDTA 0,5M Gắn nối ion hóa trị II (C10H14N2Na2O8.2H2O, M (Mg++, Ca++…) có = 372,54 g / mol) dịch ly trích, ngăn chặn hoạt động enzyme phân hủy DNA Các enzyme hoạt động mạnh có mặt ion hóa trị II ion Mg++ Tris-HCl 1M (C4H12ClNO3, M = 157,56 g / mol) Pha 100ml - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất lần Khuấy tan - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất lần cho đủ 100ml - Hấp 121oC/20phút trƣớc dùng Dung dịch đệm, đảm bảo Pha 100ml mơi trƣờng ly trích ổn - 15,7 g bột Tris-HCl + định pH8 Ở độ pH 80ml nƣớc cất lần DNA ổn định Khuấy tan -5- Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất lần cho đủ 100ml Hấp 121oC/20 phút trƣớc dùng Môi trƣờng đệm thuận Pha 100ml lợi cho việc kết tủa - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc DNA cất lần Khuấy tan - Hấp 121oC/20 phút trƣớc dùng - NaCl 5M (M = 58,44 g / mol) TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất lần - Hấp 121oC/20 phút trƣớc dùng TE 1X Hòa tan DNA EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M = 82,03 g / mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% điều kiện -20oC Pha 100ml 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất lần Pha 100ml - 57ml nƣớc cất lần + 2g CTAB (lắc nhẹ bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt) - Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml β - mercaptro Ethanol thêm vào trƣớc sử dụng Bọc giấy bạc, trữ 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp Pha 100ml - 24,6g bột Sodium Acetate + 100ml nƣớc cất lần Khuấy tan Hấp 121oC/20 phút trƣớc dùng RNase (Ribonuclease) (10%, w/v) Enzyme thủy phân RNA Pha 1ml có dịch trích - 10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất lần Bọc giấy bạc, trữ 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp Bảo vệ DNA Dung dịch gốc Mercaptro Ethanol -6- PHỤ LỤC 3: Quy trình ly trích DNA từ mẫu Đƣng, sử dụng nitơ lỏng Bƣớc Vortex 800 Lấy 0,2 g non rửa lau vịng / phút khơ Nghiền nitơ lỏng Thêm 1,2 ml dịch trích EB có Ủ 650C / h PVP Bƣớc Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ Ly tâm 11.000 vòng 15 phút 4oC Thu 500 l dịch Bƣớc Lặp lại bƣớc Thu 300 l dịch Bƣớc Thêm 200 l dung dịch isopropanol lạnh Bƣớc Thêm 20 l muối Sodium acetate M, 640 l Ethanol 100% Bƣớc Ly tâm 11.000 vòng, 15 phút 4oC Thu 700 l dịch Tủa -200C Qua đêm Ủ 370 C Bƣớc Ly tâm 11.000 vòng, 15 phút 4oC Đổ bỏ dịch Thu kết tủa trắng Bƣớc Cho vào 300 l TE 1X 1h Trộn Ủ – 200 C / h Bƣớc Ly tâm 11.000 vòng 25 phút 40C Đổ bỏ dịch Buớc 12 Bảo quản mẫu -20oC Bƣớc 10 Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% cách ly tâm 12.000 vòng phút 40C Đổ bỏ dịch Bƣớc 11 Lặp lại bƣớc 10 Để khô cặn 370C, hòa tan cặn 50 l TE 1X Ủ 370 C / h -7- PHỤ LỤC 4: Kết OD (Optical Density) 25 mẫu DNA có kết điện di tốt STT TÊN MẪU TỶ LỆ OD Abs 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 27 28 29 30 31 33 36 1.24 11.1 11.3 11.4 11.5 11.6 12.8 1B.23 2B.14 2B.15 2B.19 2B.25 2B.26 7.10 7.11 7.12 7.13 7.9 2.03300 2.01150 1.71620 1.80010 1.74413 1.47940 2.01140 1.98640 2.01530 1.79630 2.00030 1.65810 1.54730 2.11180 1.65810 1.79390 2.43260 2.01920 1.52800 1.61700 1.74460 1.65590 2.01140 1.97540 2.03300 0.11357 0.18893 6.2866 E - 0.13046 0.13435 0.32869 5.8861 E - 0.19329 6.0973 E - 0.26305 0.19039 0.34877 0.23938 9.1696 E - 0.34877 0.26242 6.7916 E - 0.18792 0.26414 0.15273 0.13399 0.14475 5.8861 E - 0.19388 0.18783 Abs 4.8260 E - 9.39250E - 3.6631 E - 7.2470 E - 7.7158 E - 0.22218 2.9263 E - 9.7306 E - 3.0255 E - 0.14644 9.5182 E - 0.21035 0.15471 1.9364 E - 0.21035 0.16290 2.7919 E - 9.3068 E - 0.17287 9.4405 E - 7.6805 E - 8.7415 E - 2.9263 E - 9.8145 E - 9.2391 E - HÀM LƢỢNG DNA (ng / μl) 540.61930 850.23970 263.55554 559.70140 567.29270 1267.61210 264.88889 865.49250 274.60217 1127.40050 854.89790 1436.50330 948.74420 507.05744 1436.50330 1064.18180 326.68324 846.97200 1039.10860 620.81370 566.29910 595.78350 264.88889 866.18320 848.84310 -8- PHỤ LỤC 5: Kết OD (Optical Density) 11 mẫu DNA có kết điện di không tốt STT TÊN MẪU TỶ LỆ OD 10 11 11.2 11.7 2B.16 2B.17 2B.18 1.20 2B.21 2B.22 32 34 35 1.75350 1.09540 1.26960 1.21280 1.46260 1.14390 1.36770 1.52920 1.36130 1.51950 1.21140 Abs Abs 6.5513 E - 1.9694 E - 1.4285 E - 1.2716 E - 0.32831 1.5054 E - 8.5273 E - 0.27609 0.33904 0.28539 1.3666 E - 3.7360 E - 1.7979 E - 1.1251 E - 1.0485 E - 0.22448 1.3161 E - 6.2346 E - 0.18054 0.24906 0.18782 1.11281E - HÀM LƢỢNG DNA (ng / μl) 277.58077 59.15086 49.34905 42.23764 1256.94190 47.31006 311.92157 1086.66210 1235.94560 1118.95110 45.89834 PHỤ LỤC 6: Bảng mã hóa số liệu điện di mẫu Đƣng -9- PHỤ LỤC 7: Bảng mã hóa số liệu điện di kích thƣớc band 14 mẫu Đƣng PHỤ LỤC 8: Kết đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS mẫu - 10 - PHỤ LỤC 9: Kết đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS 14 mẫu ... Minh, 9/2007 “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD? ?? Giáo... thực đề tài: “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD? ?? 1.2 Mục... vùng khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh 2.1.2.3 2.1.3 2.2 Hệ sinh vật rừng ngập mặn Cần Giờ Thực trạng rừng ngập mặn Cần Giờ Cây Đƣng (Rhizophora mucronata