BƢỚC đầu HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP và NGHIÊN cứu sự đa DẠNG DI TRUYỀN cây mắm TRẮNG (avicenni alba) tại KHU dự TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP mặn cần GIỜ BẰNG kỹ THUẬT RAPD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHƢỚC DOANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng / 2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******************* BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS BÙI MINH TRÍ NGUYỄN PHƢỚC DOANH Niên khóa: 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng / 2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ  Con muốn hôn lên đôi vầng trán nhiều nếp nhăn Cha Mẹ để bày tỏ lòng yêu thƣơng với ngƣời Suốt đời xin khắc ghi công ơn sinh thành, dƣỡng dục Cha Mẹ nuôi dƣỡng khôn lớn cho ăn học nên ngƣời Con muốn Cha Mẹ biết yêu Cha Mẹ nhiều lắm, ln tự hào Cha Mẹ Con xin chân thành biết ơn ngƣời thân yêu gia đình ln động viên tạo điều kiện cho ăn học đến ngày hôm Em xin gởi lòng biết ơn đến:  Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh  Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh  Ban Chủ nhiệm Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ sinh học  Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ, anh Bình, anh Kiệt thuộc phịng kỹ thuật tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho phép em thực đề tài Em xin đặc biệt gởi lòng biết ơn tri ân sâu sắc đến Thầy - Tiến sỹ Bùi Minh Trí – giáo viên hƣớng dẫn, nhiệt tình dẫn, giúp đỡ truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý giá nghiên cứu nhƣ sống, giúp em hoàn thành đề tài ứng dụng nhiều thời gian tới Và cảm ơn đến anh chị công tác Trung tâm phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại học Nông Lâm: chị Hƣng, chị Dung, chị Liên, anh Khoa, anh Phƣơng, anh Vũ…cùng bạn sinh viên Công nghệ sinh học K29 thƣơng yêu, chia nhiều buồn vui, động viên, giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Xin chân thành cảm ơn ! NGUYỄN PHƢỚC DOANH iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN PHƢỚC DOANH, Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Đề tài “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD” đƣợc tiến hành Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007 Mắm trắng loài ngập mặn thực sự, giữ nhiều vai trị quan trọng có phân bố rộng khu dự trữ sinh Cần Giờ Tuy nhiên, trải qua hoạt động khai thác ngƣời, quần thể mắm trắng ngày thối hóa suy giảm diện tích nghiêm trọng Vì vậy, nghiên cứu đa dạng di truyền trở nên cần thiết để cung cấp thông tin cho việc thiết lập chiến lƣợc tái tạo phục hồi đa dạng sinh học hệ sinh thái Những kết đạt đƣợc:  Thu đƣợc 50 mẫu mắm trắng có tính chất đại diện cao cho quần thể  Tối ƣu quy trình ly trích DNA, thu nhận DNA chất lƣợng cao đáp ứng yêu cầu nghiên cứu Sinh học phân tử  Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho mắm trắng, sử dụng primer OPAC10 Với 14 mẫu DNA phân tích thu đƣợc tổng cộng 49 băng, trung bình 3,5 băng cho mẫu Có băng đa hình kích thƣớc 450 bp, 390 bp, 330 bp, 300 bp,100 bp, 50 bp băng đồng hình kích thƣớc 200bp  Kết thực phản ứng RAPD đƣợc xử lý mần mềm NTSYS thu đƣợc phân loài đem phân tích Cây phân lồi cho thấy số đồng dạng di truyền cao từ 0,55 – Điều có nghĩa đa dạng di truyền quần thể mắm trắng khu dự trữ sinh Cần Giờ mức thấp cần đặc biệt ý đến cơng tác bảo tồn, phục hồi đa dạng di truyền mắm trắng đa dạng sinh học rừng Cần Giờ, đáp ứng mục tiêu phát triển bền vững rừng thời gian tới iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY NGUYEN PHUOC DOANH, Nong Lam university “PREMILINARY RESEACH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avicennia alba IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA USING RAPD” This thesis was carried out at Chemical & Biological Analysis And Experiment Center, Nong Lam university from April to August 2007 Avicennia alba is an important true mangrove species because of it’s large distribution, especially in Can Gio Mangrove Biosphere Reserve Area However, over – exploitation by human activities has induced to a steady decline and degraduation Studies on population genetics are necessary to provide basic information for establishing the strategies for conserving and recovering biodeversity of the ecosystem The obtained results were:  Fifty of Avicennia alba leaf samples were collected  The genome DNA isolation protocol was improved to get high quality DNA  The RAPD – PCR procedure was developed and optimized suitable for Avicennia alba using primer OPAC10 Totally 49 amplicons were generated with an average of 3,5 applicons per individual There were only one isomorphic băng (200 bps) and six polymorphic băngs (50 bps, 100 bps, 300 bps, 330 bps, 390 bps, and 450 bps)  A phylogenic tree was drawn by using NTSYS sofware based on RAPD results This phylogenic shown a high coefficient similarity from 0.55 to in 14 analized samples It suggested that the genetic diversity of Avicennia alba population is relatively poor So, strategies for conserving and recovering their genetic diversity in Can Gio biodiversity is urgently needed v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi Phần GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 1.4 Giới hạn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu khu dự trữ sinh Cần Giờ 2.1.1 Đặc điểm tự nhiên 2.1.2 Cấu trúc 2.1.3 Các tiềm rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.4 Vai trò khu dự trữ sinh 2.1.5 Các nguy đe dọa rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2 Giới thiệu mắm trắng (Avicennia alba) 10 2.2.1 Vùng phân bố 10 2.2.2 Hình thái học mắm trắng 11 2.2.3 Giá trị kinh tế mắm trắng 13 2.2.4 Những trạng mắm trắng rừng ngập mặn Cần Giờ 13 2.2.5 Những nghiên cứu khoa học mắm trắng 14 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3 Khái niệm đa dạng di truyền 14 2.3.1 Đa dạng sinh học 14 2.3.2 Ý nghĩa tầm quan trọng đa dạng sinh học 14 2.3.3 Các phân mức đa dạng sinh học 15 2.3.3.1 Đa dạng hệ sinh thái 15 2.3.3.2 Đa dạng loài 15 2.3.3.3 Đa dạng di truyền 16 2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học Việt Nam 17 2.4 Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật 18 2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR) 19 2.5.1 Khái niệm 19 2.5.2 Thành phần vai trò chất phản ứng PCR 19 2.5.3 Nguyên tắc phản ứng PCR 20 2.5.4 Ứng dụng kỹ thuật PCR 21 2.5.5 Ƣu nhƣợc điểm kỹ thuật PCR 21 2.6 Các thị phân tử dùng nghiên cứu tính đa dạng di truyền 22 2.6.1 Nhóm khơng dựa PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 22 2.6.2 Nhóm dựa PCR 23 2.6.2.1 SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 23 2.6.2.2 Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) 24 2.6.2.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 25 2.6.2.4 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 30 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 33 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 33 3.1.1 Thời gian tiến hành 33 3.1.2 Địa điểm 33 3.2 Vật liệu nghiên cứu 33 3.2.1 Mẫu thực vật 33 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 34 3.2.2.1 Hóa chất dùng ly trích DNA 34 3.2.2.2 Hóa chất dùng kiểm tra DNA 35 3.2.2.3 Hóa chất dùng để thực phản ứng RAPD 36 3.2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 36 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 3.3.1 Phƣơng pháp ly trích DNA 37 3.3.2 Kiểm tra DNA ly trích 39 3.3.2.1 Kiểm tra định tính DNA phƣơng pháp điện di gel 39 3.3.2.2 Kiểm tra định lƣợng DNA quang phổ kế 39 3.3.3 Thực kỹ thuật RAPD 40 3.3.4 Phân tích số liệu phần mềm NTSYSpc2.1 42 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Kết thu thập mẫu mắm trắng khu dự trữ sinh Cần Giờ 43 4.2 Kết trình bảo quản mẫu 44 4.3 Kết trình ly trích DNA tổng số 44 4.4 Kết trình thực phản ứng RAPD 47 4.4.1 Kết thí nghiệm 47 4.4.2 Kết thí nghiệm 50 4.5 Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền mắm trắng khu dự trữ sinh Cần Giờ 50 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD nghiệm thức 40 Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD nghiệm thức 40 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất phản ứng RAPD nghiệm thức 41 Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD nghiệm thức 41 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 4.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 47 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Hình 2.2 Cây mắm trắng khu dự trữ sinh Cần Giờ 11 Hình 2.3 Lá hoa mắm trắng 12 Hình 2.4 Trái mắm trắng 12 Hình 2.5 Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR 20 Hình 2.6 Cơ chế cắt enzyme MseI EcoRI 26 Hình 2.7 Cơ chế gắn adapter MseI adapter EcoRI 26 Hình 2.8 Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc phản ứng AFLP 27 Hình 2.9 Cơ chế khuếch đại chọn lọc phản ứng AFLP 28 Hình 2.10 Cơ chế phản ứng kỹ thuật AFLP 29 Hình 2.11 Sự bắt cặp khuếch đại phản ứng RAPD – PCR 30 Hình 4.1 Sơ đồ vị trí lấy mẫu Khu Dự trữ sinh Cần Giờ 43 Hình 4.2 Kết ly trích theo quy trình quy trình 45 Hình 4.3 Kết ly trích theo quy trình 45 Hình 4.4 Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích tối ƣu 46 Hình 4.5 Kết ly trích theo quy trình 46 Hình 4.6 Kết thực phản ứng RAPD nghiệm thức 48 Hình 4.7 Kết thực phản ứng RAPD nghiệm thức 48 Hình 4.8 Sản phẩm RAPD với primer mắm đen (Avicennia officinalis) 49 Hình 4.9 Sản phẩm RAPD thí nghiệm mắm trắng 50 Hình 4.10 Kết thực RAPD mắm trắng 51 Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích 52 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 47 Nghiền 0,4 g N2 lỏng thành bột mịn Thêm ml dịch trích EB, vortex kĩ, ủ 650C/1 Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/ 40C, thu V dịch Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 1:1, ủ - 200C qua đêm Thêm V’ hỗn hợp CIA, đảo Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C, thu dịch Thêm 1V hỗn hợp CIA, đảo Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C, thu V’ dịch Ly tâm 9.000 vòng/20 phút/40C, đổ bỏ dịch trong, thu tủa Thêm 300µl TE1X, ủ 370C/30 phút Thêm 20 µl Sodium acetate 640 µl Ethanol 100%, đem ủ -200C/1 Ly tâm 8.000/20 phút/40C Đổ bỏ dịch trong, thu tủa Hịa tan tủa 100 µl TE1X, ủ 370C/30 phút Bảo quản -200C Lặp lại bƣớc 10, làm khơ tủa DNA khơng khí Rửa cặn với 300 µl Ethanol 70% cách ly tâm phút/6.000 vịng Sơ đồ 4.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích Đây quy trình ổn định có độ tin cậy, vấn đề cịn lại thao tác hút dịch sau lần ly tâm đòi hỏi phải cẩn thận, tránh hút vào lớp ngăn cách pha Chúng tiến hành ly trích 48 mẫu mắm trắng, kết thu đƣợc 40 mẫu cho băng DNA rõ nét, mẫu cho băng DNA mờ (mẫu vị trí 1,2,3,4,19,33) mẫu cho băng DNA mờ ( mẫu số 31 50), đạt tỉ lệ 83% Với kết này, mẫu thu đƣợc hồn tồn thực phản ứng RAPD 4.4 Kết thực phản ứng RAPD 4.4.1 Kết thí nghiệm Nghiệm thức 1: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 48 Sử dụng primer OPAC10 primer với thành phần chất chu kì nhiệt nêu bảng 2.1 2.2 để thực phản ứng RAPD, thu đƣợc kết khơng có băng gel điện di, nhƣ thể hình 3.6 Khơng có sản phẩm tạo thành Hình 4.6 Kết thực phản ứng RAPD nghiệm thức Trong nghiệm thức này, chúng tơi sử dụng quy trình phân tích RAPD Lâm Vỹ Nguyên, 2006 cho đƣớc Mặc dù với quy trình này, Lâm Vỹ Nguyên thu đƣợc kết tốt Theo chúng tôi, điều số lý sau:  Thao tác chúng tơi cịn chƣa xác  Đây chƣa phải quy trình phù hợp cho mắm trắng Nghiệm thức 2: Khi sử dụng primer OPAC10 primer với chu kì nhiệt thành phần hóa chất nhƣ đƣa bảng 2.3 2.4, thu đƣợc băng chạy với primer OPAC10, băng chạy với primer nhƣ hình 3.7 OPAC10 Primer Avicennia alba Avicennia officinalis Avicennia marina Hình 4.7 Kết thực phản ứng RAPD nghiệm thức LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 49 Từ kết này, kết luận thực phản ứng RAPD theo điều kiện nghiệm thức phù hợp cho mắm trắng Với OPAC10, thu đƣợc băng cho mẫu DNA đem phân tích Các băng tách rõ quan sát mắt thƣờng Với primer 1, kết PCR tốt nhƣng thu đƣợc băng đồng hình Do có băng nên kết thu đƣợc thí nghiệm khơng có ý nghĩa việc so sánh đa dạng di truyền mắm trắng Tuy nhiên so sánh kết với kết chạy primer loài mắm đen (Avicennia officinalis) mắm biển (Avicennia marina), chúng tơi kết luận băng đặc trƣng cho mắm trắng mà cịn cho chi Avicennia vùng bảo tồn chi Avicennia, thị phân tử để phân biệt chi mắm với chi khác họ Avicenniacea Kết điện di với ladder cho thấy băng có kích thƣớc khoảng 400 bp Với kết nhƣ trên, định khảo sát thêm số primer khác với mong muốn tìm đƣợc primer cho sản phẩm khuếch đại gel cao nhƣ thí nghiệm Ladder 1kb Băng đặc trưng 400 bp Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm RAPD với primer mắm đen (Avicennia officinalis) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 50 4.4.2 Kết thí nghiệm Primer Primer RAH8 OPA05 OPA10 Hình 4.9 Sản phẩm RAPD thí nghiệm mắm trắng Với primer sử dụng, có primer OPA05 OPA10 khơng cho băng nào, primer primer cho băng, primer RAH8 cho băng Theo chúng tôi, lý khơng có băng mẫu thực với primer OPA05 OPA10 primer đƣợc bảo quản thời gian dài (từ năm 2004), hoạt tính giảm đi, khơng xảy phản ứng khuếc đại Ở primer khác, có cho băng, nhƣng số băng cịn (chỉ từ – băng), chúng tơi khơng chọn để phân tích đa dạng di truyền Với kết trên, định sử dụng primer OPAC10 để thực phản ứng RAPD, phân tích đa dạng di truyền mắm trắng 4.5 Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền mắm trắng Khu Dự trữ sinh Cần Giờ Chúng tiến hành phản ứng RAPD với primer OPAC10 sử dụng thành phần hóa chất chu kì nhiệt nghiệm thức 2, thí nghiệm 16 mẫu DNA ly trích có kết đo OD đạt từ 1,8 -2,2 Kết có mẫu khơng cho sản phẩm khuếch đại Đối chiếu với thao tác thí nghiệm, nhận thấy mẫu cuối chúng tơi tiến hành chia từ ống trộn sang eppendorf khác, hao LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 51 hụt tránh khỏi tiến hành với thể tích nhỏ nhƣ vậy, nồng độ thành phần chất mẫu bị thay đổi, phản ứng khuếch đại không xảy Với 16 mẫu thực phản ứng RAPD – PCR, thực thành công 14 mẫu (chiếm tỉ lệ 87%), thu đƣợc tổng cộng 49 băng, với băng có kích thƣớc khác nhau, trung bình 3,5 băng/mẫu Số băng tối đa thu đƣợc băng (ở mẫu 11.AA07 5A.AA19), số băng băng (thu đƣợc đƣợc 2mẫu 11.AA09 11.AA11) Măc dù số băng thấp nhƣng thấy xuất băng đa hình mẫu Kết thu đƣợc băng đa hình (chiếm tỉ lệ 85%) băng đồng hình (chiếm tỉ lệ 15%) có kích thƣớc khoảng 200 bp AA01 AA03 ladder AA06 AA07 AA08 AA09 AA11 AA12 AA13 AA19 AA25 ladder AA32 AA45 AA47 AA48 AA49 Hình 4.10 Kết thực RAPD mắm trắng Trong mẫu phân tích, băng đồng hình 200 bp ln xuất hiện, chúng tơi nghĩ băng đặc trƣng để phân biệt mắm trắng với khác chi mắm Từ kết điện di thu đƣợc gel điện di, chúng tơi mã hóa số liệu thành dạng nhị phân (1 có băng, khơng có băng), đem kết phân tích với phần mềm NTSYSpc2.1 để phân tích đa dạng di truyền Kết chúng tơi thu đƣợc phân nhóm mẫu phân tích LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 52 17.AA01 17.AA03 21.AA06 11.AA09 11.AA11 5A.AA19 10B.AA25 10A.AA12 7.AA45 11.AA07 10A.AA12 2B.AA48 6B.AA32 10A.AA13 1.AA49 0.55 0.66 0.78 0.89 1.00 Coefficient Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích Với 14 mẫu đem phân tích chia thành nhánh có khoảng cách phân nhóm 0,55 Nhóm I gồm mẫu 10A.AA12, 2B.AA48, 6B.AA32, 10A.AA13 1.AA49 Nhánh lại chia thành nhánh phụ có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,81 – 1, điều cho thấy có tƣơng đồng cao mẫu Đặc biệt cặp mẫu 10A.AA13 1.AA49; 10A.AA12 2B.AA48, có hệ số đồng dạng lên đến 1, chứng tỏ cặp mẫu có gien hồn tồn giống Mặc dù mẫu đƣợc lấy tiểu khu khác khoảng cách xa Điều chúng đƣợc tái sinh thời điểm từ nguồn mẹ giống mang gien giống Bên cạnh đó, so sánh tọa độ lấy mẫu mẫu này, nhận thấy chúng đƣợc lấy tiểu khu liền kề dọc theo đƣờng thủy, nhƣ theo chúng tơi nhận định, dạng phát tán tự nhiên mắm trắng Trong nhánh II gồm mẫu lại đƣợc chia làm nhiều nhánh nhỏ, phức tạp, có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,63 – Đáng ý mẫu 17A.AA01 17A.AA03 có hệ số đồng dạng di truyền Hai mẫu đƣợc lấy từ tiểu khu 17, mẫu 17A.AA01 con, mẫu 17A.AA03 trƣởng thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 53 Điều cho thấy đƣợc phát tán tự nhiên đƣợc trồng từ nguồn gốc chung Tƣơng tự, hai mẫu 11.AA09 11.AA11 đƣợc lấy tiểu khu 11 có hệ số đồng dạng di truyền 1, Nhƣ vậy, chúng đƣợc phát tán tự nhiên nguồn gốc chung, đƣợc tái sinh theo chƣơng trình phục hồi rừng với nguồn giống Nhƣ cách tổng quát, kết phân tích phần mềm NTSYSpc2.1 cho thấy quần thể mắm trắng khu dự trữ sinh Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền tƣơng đối cao, từ 0,55 – 1, có đến cặp mẫu có hệ số Điều nhận định đa dạng di truyền quần thể mắm trắng nơi mức thấp Ở mẫu đƣợc lấy theo đƣờng lấy theo đƣờng sơng cho thấy có vài trƣờng hợp hệ số đồng dạng di truyền Với kết nhƣ vậy, nhận định rằng, mắm trắng tiên phong rừng ngập mặn nhƣng khơng phải chủ lực rừng Cần Giờ, chủ yếu mọc tự nhiên Công tác tái tạo, trồng quần thể mắm trắng đƣợc tiến hành phân bố rộng mắm trắng chủ yếu tính thích nghi, sinh trƣởng mạnh mắm trắng rừng ngập mặn, hình thức sinh sản chủ yếu mắm trắng tự thụ phấn phát tán, lan rộng nhờ vào hạt mọc lên từ rễ chính, hình thức phán tán hạt chiếm ƣu mắm trắng Ở mọc theo sơng, nhờ dịng nƣớc mà hạt mắm trắng đƣợc mang khắp nơi Có thể lý mà tính đa dạng di truyền quần thể mắm trắng nơi mức thấp Bên cạnh nguồn giống mắm trắng đƣợc tái sinh lúc ban đầu chủ yếu lấy từ nguồn giống chỗ mức độ đa dạng di truyền thấp điều hồn tồn xảy Nhƣ sau, hệ số đồng dạng di truyền quần thể mắm trắng nơi tăng cao tự thụ phấn lại giống Điều dẫn đến hủy diệt quần thể mắm trắng nơi có dịch bệnh, sâu hại cơng diện rộng Vì cơng tác tái tạo, phục hồi tính đa dạng di truyền mắm trắng cần đặc biệt đƣợc trọng để nâng cao tính đa dạng quần thể mắm, giữ gìn tính đa dạng sinh học rừng giữ gìn hệ sinh thái rừng bền vững LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 54 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận  Mẫu mắm trắng không giữ đƣợc lâu điều kiện bảo quản 40C giữ đƣợc khoảng tháng điều kiện -200C  Quy trình ly trích 4, sử dụng N2 lỏng ổn định (đạt tỉ lệ 83%), cho DNA đạt tiêu chuẩn phân tích sinh học phân tử  Quy trình RAPD theo nghiệm thức 2, sử dụng primer OPAC10 cho kết ổn định, vấn đề lại thao tác, nên trộn thật kĩ để đảm bảo nồng độ chất đƣợc xác  Primer cho băng có kích thƣớc 400 bp đặc trƣng cho loài mắm đƣợc khảo sát  Phân tích kết thực phản ứng RAPD với primer OPAC10 quần thể mắm trắng Khu dự trữ sinh rừng Cần Giờ cho hệ số đồng dạng di truyền nhân nhóm di truyền dao động từ 0,55 –  Sự đa dạng di truyền quần thể mắm trắng mức thấp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 55 5.2 Đề nghị  Khảo sát thêm primer khác mắm trắng cho số sản phẩm khuếch đại nhiều hơn, có ý nghĩa việc nghiên cứu đa dạng di truyền  Phân tích số lƣợng mẫu lớn kết xác  Tách riêng băng 400 bp chạy RAPD với primer băng 200 bp chạy với primer OPAC10 đem giải trình tự phục vụ cho cơng tác phân loại giống mắm trắng với khác họ Avicenniacea  Phải có sách làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng bảo đảm phát triển bền vững Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ nói chung quần thể mắm trắng (Avicennia alba) nói riêng Trong công tác tái tạo quần thể mắm trắng, nên thu thập thêm nhiều nguồn giống từ địa phƣơng khác, nên trồng xen kẽ thuộc tiểu khu khác xen kẽ đƣờng thủy, đƣờng bộ, để nâng cao tính đa dạng vốn có quần thể mắm trắng Khu Dự trữ sinh Cần Giờ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC Phạm Văn Bình, 2005 Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Acanardium occidentale L.) trồng tỉnh Ninh Thuận kỹ thuật RAPD AFLP Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Phạm Thành Hổ, 1998 Di truyền học Nhà xuất Giáo Dục, TP Hồ Chí Minh Phạm Thành Hổ, 2006 Bài giảng Một số thị phân tử ứng dụng công tác giống trồng 5.Lê Văn Khôi, Viên Ngọc Nam, Lê Đức Tuân, 2006 Khôi phục phát triển bền vững hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh (1978 – 2000) Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu Công nghệ sinh học Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp Lâm Vỹ Nguyên, 2006 Nghiên cứu đa dạng di truyền đƣớc đôi (Rhizophora apiculata BLUME) khu Dự trữ sinh Rừng ngập mặn Cần Giờ kỹ thuật RAPD Đại học Nông Lâm Phạm Bình Quyền, 2002 Đa dạng sinh học Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội 10 Lê Duy Thành, 2001 Cơ sở di truyền chọn giống thực vật Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội 159 trang 11 Nguyễn Đức Thành, 2004 Một số kỹ thuật thị phân tử Nhà xuất Viện khoa học công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ sinh học Hà Nội LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 57 12 Bùi Trang Việt, 2002 Bài giảng Sinh học phân tử Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU NƢỚC NGỒI 13 Ambike Baldev Gaikwad Amplified Fragment Length polymorphism (AFLP) technique 14 Kazutoshi Okuno and Shuichi Fukuoka, 1998 Manual for DNA extraction in plants Japan international cooperation agency TRANG WEB 15 http://mekonginfo.org/mrc_en/contac.nsf/$FILE/Mamldong.htm 16 http://species.wikimedia.org/wiki/Avicennia_alba 17 http://vi.wikipedia.org/wiki/M%E1%BA%AFm_(c%C3%A2y) 18 http://www.biotech.ufl.edu/WorkshopsCourses/ Word_files/AFLP%20Workshop%20Manual.doc 19 http://www.dulichvn.org.vn/thongtinquanly/dautudulich/kdl_cangio.htm 20 http://www.keygien.com/technologies/technologies_aflp.htm 21 http://www.vacne.org.vn/Gioi%20thieu/gioithieu.htm 22 http://www.vacne.org.vn/Thongtin_Hoatdong/Q4_06.htm#Sinh%20Quyen LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Phụ lục Bảng thống kê mẫu mắm trắng thu thập Khu Dự trữ sinh Cần Giờ STT Tên mẫu Tên tiểu Tọa độ GPS Đặc điểm hình thái khu lấy 48P UTM AA01 17 0707699 1153876 Cây non, nhiều hoa, chƣa trái AA02 17 0706956 1153990 Cây cao, xanh tƣơi, nhiều trái AA03 17 0706752 1154072 Cây già, sâu bệnh nhiều AA04 21 0706678 1154972 Thân nhỏ, lùn, nhiều cành ngang AA05 21 0706898 1156443 Cây to cao nhung chƣa thấy hoa trái AA06 21 0706380 1157741 Cây trẻ, có hoa, chƣa trái, bị sâu AA07 11 0705765 1158774 Cây trẻ, tƣơi tốt, cành xum xuê, hoa trái nhiều AA08 11 0705441 1159250 Cây trƣởng thành, cao, xanh tốt AA09 11 0705161 1159715 Cây non, chƣa có hoa, trái, sâu nhiều 10 AA10 11 0704781 1160407 Lá có nhiều vết sâu bệnh, già cỗi 11 AA11 11 0704086 1161940 Cây già cỗi, sâu nhiều, bạc xám 12 AA12 10A 0703881 1162362 Cây non, sâu nhiều 13 AA13 10A 0703258 1163077 Cây cao, to , tƣơi tốt, không bị sâu so với xung quanh 14 AA14 10A 0702913 1163559 Thân nhỏ, cành gầy guộc, bị sâu 15 AA15 0702489 1164263 Cây cao, ốm, nhiều cành, già cỗi 16 AA16 0701380 1165102 Cây mọc gò mối, già cỗi 17 AA17 0700452 1165786 Không bị sâu bệnh gần kề có nhiều bệnh tích 18 AA18 0700650 1166971 Thân gầy, sâu bệnh, có trái 19 AA19 0700167 1167848 Cây non, tuoi tốt LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 20 AA20 0699834 1168876 Cây già, cao, nhiều sâu 21 AA21 0699673 1169617 Cây to, cao, tƣơi tốt 22 AA22 0699710 1169929 Cây cao, nhiều sâu 23 AA23 10B 0704861 1161423 Thân to, cành nhiều, bị sâu nhẹ 24 AA24 10B 0704929 1161680 Rất cành, khơng bị sâu, chƣa có hoa 25 AA25 10B 0704353 1167004 Ít bị sâu bệnh so với xung quanh 26 AA26 10A 0704815 1162305 Cây cao, cằn cỗi, sâu nhiều 27 AA27 10A 0704402 1162602 Thân cong queo, nhiều cành 28 AA28 10A 0704558 1162782 Cây cao, to , tƣơi tốt 29 AA29 10A 0704676 1163013 Nhiều trái, tƣơi tốt 30 AA30 10A 0704682 1163310 Thân ốm, hoa, nhiều sâu 31 AA31 6B 0705498 1163893 Lá xanh tƣơi, hoa nhiều 32 AA32 6B 0706990 1163864 Cây non, không sâu 33 AA33 6B 0707502 1163708 Cây nhiều hoa, cành nhiều 34 AA34 6B 0708076 1163518 Thân thẳng, nhiều cánh, tốt 35 AA35 0710899 1165414 Lá bị nâu, nhiều sâu bệnh 36 AA36 0711177 1165656 Cây non,rất tƣơi tốt 37 AA37 0711211 1165828 Thân nhỏ, cao chƣa có hoa 38 AA38 0711384 1166061 Cây non, sâu nhiều 39 AA39 2B 0712166 1167219 Cây cao, không sâu, cành 40 AA40 2B 0712411 1167411 Thân nhiều cành, hoa tƣơi tốt 41 AA41 0712675 1167702 Cây trƣởng thành, xanh tốt 42 AA42 0712901 1167384 Hoa to, xanh tốt 43 AA43 0713223 1167803 Thân nhỏ, nhiều canh, có hoa 44 AA44 0713506 1168311 Thân to, tƣơi tốt 45 AA45 0714012 1168222 Lá bạc nhiều, sâu bệnh, thân cao 46 AA46 0714263 1168125 Thân nhỏ, bị sâu nhẹ 47 AA47 2B 0715316 1168346 Nhiều cành, xanh tốt 48 AA48 2B 0715338 1168639 Chƣa có hoa, to, cao 49 AA49 0713958 1169946 Cây non, bị sâu nhẹ 50 AA50 0713439 1170475 Cây cao, nhiều cành, bị sâu nhiều LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục Bảng số đo OD mẫu ly trích # 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Name AA05 AA06 AA08 AA09 AA10 AA11 AA12 AA13 AA14 AA15 AA16 AA18 AA20 AA21 AA22 AA23 AA24 AA25 AA26 AA27 AA28 AA29 AA30 AA32 AA34 AA35 AA36 AA37 AA38 AA39 AA40 AA41 AA42 AA43 AA44 AA45 AA46 AA47 AA48 AA49 Dilut Factor 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 Ratio Abs Abs 1.91300 0.12156 6.3545E-2 1.83980 0.10012 5.4418E-2 1.90610 7.0246E-2 3.36853E-2 1.98070 9.9778E-2 5.0376E-2 2.03590 0.14718 7.2293E-2 1.92170 9.4518E-2 4.9186E-2 2.08880 0.15239 7.2957E-2 2.03000 8.8066E-2 4.3383E-2 2.04050 0.10603 5.1963E-2 1.98990 0.11276 5.6663E-2 2.02680 0.19094 9.4208E-2 1.97070 6.2707E-2 3.1819E-2 2.04920 3.7462E-2 1.8581E-2 2.07400 1.6814E-2 8.1072E-3 1.88520 2.2685E-2 1.2033E-2 2.79790 2.9511E-3 1.0548E-3 2.08490 3.0027E-2 1.4402E-2 1.79140 8.1058E-2 4.5249E-2 1.83270 7.9355E-2 4.3300E-2 1.84070 7.8523E-2 4.2660E-2 1.96280 0.12397 6.3162E-2 1.97520 0.12302 6.2280E-2 2.18210 2.5607E-2 1.1735E-2 2.16600 2.5790E-2 1.1907E-2 1.95050 0.53627 0.27494 2.06870 1.16020 0.56084 2.25560 2.9507E-2 1.3082E-2 2.22720 3.0115E-2 1.3522E-2 2.23550 1.9769E-2 8.8434E-3 2.16300 2.0506E-2 9.4805E-3 2.11070 1.6807E-2 7.9627E-3 2.09760 3.6278E-2 1.7295E-2 1.98150 6.2750E-2 3.1669E-2 2.04170 0.18972 9.2922E-2 2.02050 0.11123 5.5.50E-2 2.04880 0.10576 5.1622E-2 2.03360 8.7981E-2 4.3263E-2 2.09790 0.15192 7.2417E-2 1.98180 9.1039E-2 4.5937E-2 2.00540 9.8450E-2 4.9093E-2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục Bảng mã hóa kết điện di mẫu đem chạy RAPD phân tích với phần mềm NTYSYSpc2.1 Tên mẫu 17.AA01 17.AA03 21.AA06 11.AA07 11.AA09 11.AA11 10A.AA12 10A.AA13 5A.AA19 10B.AA25 6B.AA32 7.AA45 2B.AA48 1.AA49 450bp 390bp 330bp 300bp 200bp 100bp 50bp 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... luanvanchat@agmail.com “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD? ?? 1.2 Mục đích... Chí Minh Đề tài “BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD? ?? đƣợc tiến... trích DNA bƣớc đầu hồn thiện quy trình thực phản ứng RAPD thích hợp cho mắm trắng  Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền quần thể mắm trắng (Avicennia alba) khu dự trữ sinh Rừng ngập mặn Cần Giờ 1.3