2.4.1. Các loại enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn là những endonuclease, có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí xác định. Chính vì đặc tính đó mà chúng đƣợc chia làm 3 loại (type). [5]
Type I: khi một enzyme nhận biết đƣợc một trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến một vị trí cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng độ vài chục nucleotide.
Type II: enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí nhận biết đó.
Type III: enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide.
Type I và Type III có vai trò rất hạn chế, tuy nhiên type II là những enzyme cắt có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật biến đổi di truyền.
2.4.2. Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn
Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotide đặc trƣng, các trình tự này thƣờng bao gồm 4 – 8 nucleotide. Từ đó, DNA hệ gene sẽ đƣợc cắt ra thành những đoạn ngắn, hoặc dài có kích thƣớc khác nhau. Tuy nhiên đối với một số enzyme, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotide của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác. [5]
Một đặc trƣng quan trọng của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, có nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau nếu chúng đƣợc đọc theo chiều 5’ – 3’. Nhƣ vậy vị trí cắt giống nhau trên 2 mạch DNA.
2.4.3. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA
Việc sử dụng các enzyme cũng khá đơn giản, chỉ cần thêm một lƣợng enzyme thích hợp vào DNA mục tiêu trong dung dịch đệm thích hợp và sau đó để cho phản ứng xảy ra ở 37 C. Hoạt tính của các enzyme đƣợc biểu hiện bằng đơn vị (unit). Đó là lƣợng enzyme cần thiết để phân cắt 1 g DNA trong 1 giờ ở 37 C. Phần lớn các thí
nghiệm đòi hỏi phải phân cắt hoàn toàn DNA mục tiêu, tuy nhiên trong một số trƣờng hợp sử dụng kết hợp nhiều enzyme chỉ cần tính toán nồng độ và thời gian ủ để đạt đƣợc sự phân cắt không hoàn toàn. [5]
Các kiểu đoạn DNA tạo thành do sự phân cắt của các enzyme phụ thuộc vào trình tự nhận biết và vị trí điểm cắt trong trình tự này. Chiều dài của đoạn DNA tùy thuộc vào tần số xuất hiện của trình tự nhận biết. Vị trí cắt của enzyme sẽ xác định kiểu đầu của đoạn DNA tạo thành (đầu bằng – blunt end hay đầu dính – sticky end). Nếu RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm sẽ tạo thành các đoạn DNA có đầu bằng, sau khi cắt, hai đầu bằng không thể tự kết hợp trở lại, để nối chúng lại cần phải dùng enzyme T4 ligase. Nếu vị trí cắt của RE lệch nhau trên hai mạch thì sẽ tạo thành các đầu dính, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Việc tạo thành đầu bằng hay đầu dính có ý nghĩa rất quan trọng đối với những thao tác ở mức độ DNA, đặc tính đƣợc quan tâm nhất là khả năng cắt tạo đầu dính, đƣợc ứng dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in vitro. Hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau đƣợc cắt bởi cùng một RE sẽ có khả năng kết hợp thành một phân tử tái tổ hợp.
http://www/math.mit.edu/~lippert/18.417/lectures/02_PartialDigest/
2.5.PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.5.1. Khái niệm 2.5.1. Khái niệm
Phƣơng pháp PCR đƣợc nhà khoa học Mỹ Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 (giải Nobel Hóa học năm 1993).
Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. PCR là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản, hiệu quả, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận. [5], [10]
2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR
PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, tạo ra các đột biến gene, chẩn đoán phát hiện bệnh trên ngƣời, động vật, thực vật và kiểm nghiệm thực phẩm. [5]
Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gene (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gene quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật.
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này đƣợc kéo dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi thực hiện điện di trên gel, nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV. Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt.
2.5.3. Quy trình phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau [5]. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc Bƣớc 1 (biến tính, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thƣờng là ở nhiệt độ 94 - 95 C phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn trong vòng 30 – 60 giây.
Bƣớc 2 (lai, annealation): trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
Bƣớc 3 (kéo dài, elongation - extension): dƣới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới đƣợc tạo thành từ mạch đƣợc kéo dài. Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lƣợng DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 106
bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm đƣợc nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide và quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312 nm).
Andy Vierstraete, 1999. http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif
Hình 2.5 Phản ứng PCR. [20]
2.6.Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng
Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – World Wildlife Fund (WWF) (1989) đề xuất nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”. Đa dạng sinh học đƣợc xem xét trên ba mức độ: đa dạng hệ sinh thái, đa dạng loài và đa dạng di truyền. [13] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tính đa dạng trong thiên nhiên là nguồn tài nguyên vô tận của nhân loại, là nguồn gốc của sự thịnh vƣợng, cung cấp cho chúng ta toàn bộ thức ăn, phần lớn các loại nguyên vật liệu, hàng hoá và dịch vụ, cung cấp nguyên liệu di truyền cần thiết cho
nông nghiệp, dƣợc học, công nghệ. Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con ngƣời, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội đồng thời làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta. Vì vậy, việc duy trì đƣợc tính đa dạng sinh học sẽ giúp loài ngƣời bảo vệ môi trƣờng sống, hạn chế đến mức thấp nhất những thiệt hại do thiên nhiên hay do con ngƣời gián tiếp tạo nên nhƣ hiệu ứng nhà kính, băng các vùng cực tan, môi trƣờng đất, môi trƣờng nƣớc bị nhiễm độc phóng xạ. Chính việc lạm dụng tài nguyên thiên nhiên trong quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa con ngƣời đã, đang và sẽ gây ra những tác động lớn đến môi trƣờng làm rối loạn các hệ sinh thái tự nhiên và suy giảm tính đa dạng về sự sống trên trái đất. Trƣớc thực tế nhƣ hiện nay, việc nghiên cứu và bảo tồn tính đa dạng sinh học là một vấn đề cấp bách nhằm bảo đảm cho sự phát triển bền vững.
2.7.Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity)
Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là sự đa dạng di truyền.
2.8.Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên đồng thời cũng quan trọng đối với con ngƣời.
Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trƣờng. Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con ngƣời.
2.9.Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử phân tử
Từ khi con ngƣời biết đến sự hiện diện của gene cùng với việc Watson và Crick phát minh ra cấu trúc chuỗi DNA năm 1953, các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và trở thành công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học với độ tin cậy cao hơn. Hiện nay, con ngƣời đã tìm ra đƣợc nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử khác nhau, có thể chia ra làm 2 nhóm sau [7]:
Dựa trên PCR: RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…
Dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP.
2.9.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) 2.9.1.1. Khái niệm 2.9.1.1. Khái niệm
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA đƣợc cắt ra này lai với những probe đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả đƣợc quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao. [7], [9]
RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhƣng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe ngƣời thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lƣợng và chất lƣợng rất cao. Do đó, ngƣời ta có xu hƣớng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase.
Hình 2.6 RFLP trong trƣờng hợp có đột biến điểm. 2.9.1.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP
a. Nghiên cứu lập bản đồ gene
Mc. Couch và ctv (1988) thiết lập bản đồ di truyền nhờ marker phân tử (RFLP) trên cây lúa gồm 135 loci [9], [10]. Bản đồ gồm 12 nhiễm sắc thể (NST) với tổng cộng 1.389 cM trên genome cây lúa từ cặp lai IR34583 (indica) và Bulu Dalam (Javanica).
Ba năm sau, bản đồ thứ hai từ quần thể IRAT117 (Japonica) và Apura (indica) đƣợc công bố (Mc. Couch 1991, Tanksley và ctv 1991).
Saito và ctv (1991) thiết lập một bản đồ khác dựa trên cặp lai Kasalath (indica) và Fl134 (Japonica) với 347 RFLP marker, phủ trên 12 NST với tổng cộng 1.836 cM với 347 loci.
Để phân tích sự đa dạng di truyền của 112 giống lúa ở Châu Á, Takashige và cộng sự (1995) đã sử dụng 12 probe DNA để nghiên cứu và đã xác định đƣợc mối tƣơng quan di truyền giữa các giống lúa nói trên.
Qifa Zhang và cộng sự (1992) đã xác định đƣợc sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa indica (12 dòng) và Japonia (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP.
Yu và cộng sự (1995) cho thấy một số marker hình thái (17 marker, thí dụ nhƣ vỏ trấu màu tím, lá không có lông, hạt gạo nâu, dạng cây lùn) có mối liên kết với marker RFLP.
b. Một số ứng dụng khác
Lập bản đồ gene cho bệnh đạo ôn và các gene kháng bệnh bạc lá, rầy nâu, sâu đục thân.
Marker phân tử trong di truyền và chọn giống. Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể. Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể.
2.9.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) 2.9.2.1. Khái niệm 2.9.2.1. Khái niệm
Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1993) phát minh ra. Sau đó đƣợc Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt bằng RE từ bộ gene của đối tƣợng nghiên cứu. Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 bp. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao. [1], [3], [15], [16]
Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bƣớc cơ bản [24]
Bƣớc 1: Tách chiết DNA. AFLP đòi hỏi DNA phải có độ tinh sạch cao. Bƣớc 2: Cắt giới hạn và gắn adapter. Bƣớc này gồm có hai giai đoạn:
Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn nhờ 2 enzyme cắt. Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ sung với những đoạn DNA vừa đƣợc cắt, để trong 2 phản ứng PCR sau ngƣời ta sử dụng những primer có trình tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để các đoạn DNA vừa cắt không bắt cặp với nhau, giai đoạn cắt giới hạn và gắn adapter đƣợc xem nhƣ một.
http://www.iowalivingroadway.com/ResearchProjects/images/409b.gif
Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP. [36] Bƣớc 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification).
Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn adapter từ bƣớc 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bƣớc 2 và cộng thêm 1 nucleotide ở đầu 3’.
Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter
MseI + 1 nucleotide (thƣờng là C).
Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter
Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp những đoạn DNA đƣợc cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lƣợng của những đoạn có thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn lọc). Việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt đƣợc nhiều đoạn bổ sung với adapter.
Bƣớc này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %.