2.3.2.1. Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ
Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260 nm. Sự hấp thụ này là do sự tƣơng tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine. Dựa vào sự hấp thụ này ngƣời ta có thể định lƣợng đƣợc hàm lƣợng DNA có trong mẫu ly trích. [11], [14]
Sự hấp thụ ở đây đƣợc tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260nm tƣơng ứng với:
50 g / ml DNA sợi đôi.
40 g / ml DNA sợi đơn hay RNA.
20 g / ml oligonucleotide sợi đơn.
Từ giá trị OD đo đƣợc, ngƣời ta có thể suy ra đƣợc nồng độ acid nucleotide trong mẫu ly trích.
DNA (ng / l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n
Với
OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260 nm.
OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280 nm.
n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100).
Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết. Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác. Ngoài đỉnh hấp thụ là 280 nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các nucleoic acid và làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleoic acid. Để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của mẫu ly trích ngƣời ta tính tỷ lệ OD260nm / OD280nm.
Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7 - 2,2 thì mẫu ly trích đƣợc xem là sạch. Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều.
Tuy nhiên, việc định lƣợng bằng phƣơng pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lƣợng của DNA ly trích. Để biết chính xác chất lƣợng DNA ly trích, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel.
2.3.2.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
Trong một điện trƣờng, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện tích và kích thƣớc của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lƣợng thì phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngƣợc dấu nhanh hơn. [11], [14]
Đối với phân tử DNA, việc điện di đƣợc thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Gel là môi trƣờng xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua. Kích thƣớc phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Có hai loại gel đƣợc sử dụng tùy theo kích thƣớc và mức độ phân tách của phân tử acid nucleic: gel agarose và gel polyacrylamide.
Gel agrose: Lỗ có đƣờng kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thƣớc 300 - 10000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thƣớc khác nhau.
Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 500 bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide.
Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, ngƣời ta sử dụng một số phƣơng pháp phát hiện nhƣ sau:
Đối với gel agarose: Nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA, phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel.
Đối với gel polyacrylamide: Các phân tử DNA thƣờng đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của nó sẽ đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Ngoài ra, các phân tử DNA còn có thể đƣợc đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt.
Dựa vào kết quả điện di, chúng ta có thể biết đƣợc chất lƣợng của DNA ly trích nhƣ gãy, lẫn tạp, hay cho band sáng rõ.
2.4.Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme) 2.4.1. Các loại enzyme giới hạn 2.4.1. Các loại enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn là những endonuclease, có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí xác định. Chính vì đặc tính đó mà chúng đƣợc chia làm 3 loại (type). [5]
Type I: khi một enzyme nhận biết đƣợc một trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến một vị trí cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng độ vài chục nucleotide.
Type II: enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí nhận biết đó.
Type III: enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide.
Type I và Type III có vai trò rất hạn chế, tuy nhiên type II là những enzyme cắt có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật biến đổi di truyền.
2.4.2. Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn
Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotide đặc trƣng, các trình tự này thƣờng bao gồm 4 – 8 nucleotide. Từ đó, DNA hệ gene sẽ đƣợc cắt ra thành những đoạn ngắn, hoặc dài có kích thƣớc khác nhau. Tuy nhiên đối với một số enzyme, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotide của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác. [5]
Một đặc trƣng quan trọng của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, có nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau nếu chúng đƣợc đọc theo chiều 5’ – 3’. Nhƣ vậy vị trí cắt giống nhau trên 2 mạch DNA.
2.4.3. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA
Việc sử dụng các enzyme cũng khá đơn giản, chỉ cần thêm một lƣợng enzyme thích hợp vào DNA mục tiêu trong dung dịch đệm thích hợp và sau đó để cho phản ứng xảy ra ở 37 C. Hoạt tính của các enzyme đƣợc biểu hiện bằng đơn vị (unit). Đó là lƣợng enzyme cần thiết để phân cắt 1 g DNA trong 1 giờ ở 37 C. Phần lớn các thí
nghiệm đòi hỏi phải phân cắt hoàn toàn DNA mục tiêu, tuy nhiên trong một số trƣờng hợp sử dụng kết hợp nhiều enzyme chỉ cần tính toán nồng độ và thời gian ủ để đạt đƣợc sự phân cắt không hoàn toàn. [5]
Các kiểu đoạn DNA tạo thành do sự phân cắt của các enzyme phụ thuộc vào trình tự nhận biết và vị trí điểm cắt trong trình tự này. Chiều dài của đoạn DNA tùy thuộc vào tần số xuất hiện của trình tự nhận biết. Vị trí cắt của enzyme sẽ xác định kiểu đầu của đoạn DNA tạo thành (đầu bằng – blunt end hay đầu dính – sticky end). Nếu RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm sẽ tạo thành các đoạn DNA có đầu bằng, sau khi cắt, hai đầu bằng không thể tự kết hợp trở lại, để nối chúng lại cần phải dùng enzyme T4 ligase. Nếu vị trí cắt của RE lệch nhau trên hai mạch thì sẽ tạo thành các đầu dính, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Việc tạo thành đầu bằng hay đầu dính có ý nghĩa rất quan trọng đối với những thao tác ở mức độ DNA, đặc tính đƣợc quan tâm nhất là khả năng cắt tạo đầu dính, đƣợc ứng dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in vitro. Hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau đƣợc cắt bởi cùng một RE sẽ có khả năng kết hợp thành một phân tử tái tổ hợp.
http://www/math.mit.edu/~lippert/18.417/lectures/02_PartialDigest/
2.5.PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.5.1. Khái niệm 2.5.1. Khái niệm
Phƣơng pháp PCR đƣợc nhà khoa học Mỹ Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 (giải Nobel Hóa học năm 1993).
Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. PCR là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản, hiệu quả, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận. [5], [10]
2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR
PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, tạo ra các đột biến gene, chẩn đoán phát hiện bệnh trên ngƣời, động vật, thực vật và kiểm nghiệm thực phẩm. [5]
Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gene (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gene quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật.
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này đƣợc kéo dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi thực hiện điện di trên gel, nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV. Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt.
2.5.3. Quy trình phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau [5]. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc Bƣớc 1 (biến tính, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thƣờng là ở nhiệt độ 94 - 95 C phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn trong vòng 30 – 60 giây.
Bƣớc 2 (lai, annealation): trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
Bƣớc 3 (kéo dài, elongation - extension): dƣới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới đƣợc tạo thành từ mạch đƣợc kéo dài. Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lƣợng DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 106
bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm đƣợc nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide và quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312 nm).
Andy Vierstraete, 1999. http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif
Hình 2.5 Phản ứng PCR. [20]
2.6.Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng
Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – World Wildlife Fund (WWF) (1989) đề xuất nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”. Đa dạng sinh học đƣợc xem xét trên ba mức độ: đa dạng hệ sinh thái, đa dạng loài và đa dạng di truyền. [13]
Tính đa dạng trong thiên nhiên là nguồn tài nguyên vô tận của nhân loại, là nguồn gốc của sự thịnh vƣợng, cung cấp cho chúng ta toàn bộ thức ăn, phần lớn các loại nguyên vật liệu, hàng hoá và dịch vụ, cung cấp nguyên liệu di truyền cần thiết cho
nông nghiệp, dƣợc học, công nghệ. Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con ngƣời, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội đồng thời làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta. Vì vậy, việc duy trì đƣợc tính đa dạng sinh học sẽ giúp loài ngƣời bảo vệ môi trƣờng sống, hạn chế đến mức thấp nhất những thiệt hại do thiên nhiên hay do con ngƣời gián tiếp tạo nên nhƣ hiệu ứng nhà kính, băng các vùng cực tan, môi trƣờng đất, môi trƣờng nƣớc bị nhiễm độc phóng xạ. Chính việc lạm dụng tài nguyên thiên nhiên trong quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa con ngƣời đã, đang và sẽ gây ra những tác động lớn đến môi trƣờng làm rối loạn các hệ sinh thái tự nhiên và suy giảm tính đa dạng về sự sống trên trái đất. Trƣớc thực tế nhƣ hiện nay, việc nghiên cứu và bảo tồn tính đa dạng sinh học là một vấn đề cấp bách nhằm bảo đảm cho sự phát triển bền vững.
2.7.Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity)
Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là sự đa dạng di truyền.
2.8.Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên đồng thời cũng quan trọng đối với con ngƣời.
Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trƣờng. Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con ngƣời.
2.9.Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử phân tử
Từ khi con ngƣời biết đến sự hiện diện của gene cùng với việc Watson và Crick phát minh ra cấu trúc chuỗi DNA năm 1953, các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và trở thành công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học với độ tin cậy cao hơn. Hiện nay, con ngƣời đã tìm ra đƣợc nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử khác nhau, có thể chia ra làm 2 nhóm sau [7]:
Dựa trên PCR: RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…
Dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP.
2.9.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) 2.9.1.1. Khái niệm 2.9.1.1. Khái niệm
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA đƣợc cắt ra này lai với những probe đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả đƣợc quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao. [7], [9]
RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhƣng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe ngƣời thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lƣợng và chất lƣợng rất cao. Do đó, ngƣời ta có xu hƣớng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase.