Hình 4.8 Kết quả điện di khảo sát Primer 1.
(ĐƢ) Đưng, (C) Cóc, (ĐĐ) Đước đôi, (MĐ) Mắm đen, (MT) Mắm trắng, (MB) Mắm biển.
Tham khảo kết quả của nhóm 3 cây mắm thì band đồng hình có kích thƣớc 400 bp, quan sát gel điện di thì thấy ở cây Đƣng cũng xuất hiện band có kích thƣớc tƣơng tự. Do chỉ mới khảo sát một lần đồng thời ở cây cóc và cây đƣớc đôi không xuất hiện band rõ ràng nên chƣa đủ cơ sở kết luận đây là band đại diện cho nhóm cây ngập mặn hay không. Vì vậy nên tiến hành thêm nhiều thí nghiệm kiểm chứng để có đƣợc một kết quả chính xác hơn.
Hình 4.9 Kết quả điện di khảo sát Primer 9 và 2.
(MĐ) Mắm đen, (MT) Mắm trắng, (C) Cóc, (ĐĐ) Đước đôi, (ĐƢ) Đưng, (MB) Mắm biển.
Band đồng hình
Hình 4.10 Kết quả điện di khảo s át Primer RAH8.
Kết quả điện di cho thấy, so với những cây khác thì Đƣng cho số band nhiều hơn, các band phân tách tƣơng đối rõ, có sự đa hình giữa các cây Đƣng với nhau (hình 4.7, 4.10). Cụ thể nhƣ sau:
Hình 4.7: Primer OPAC10 tạo nhiều band hơn các mồi khác, các mẫu đều cho
nhiều band. Cụ thể, đối với mẫu 7.12 có 8 band, mẫu 2B.14 có 6 band. Hình 4.8: Primer 1: mẫu 7.12 có 4 band.
Hình 4.9: Primer 2: mẫu 7.12 có 1 band. Hình 4.9: Primer 9: mẫu 7.12 có 2 band.
Hình 4.10: Primer RAH8: lần lƣợt theo thứ tự mẫu 7.12 có 4 band, mẫu 2B.14 có 1 band. Để thấy rõ sự khác biệt trong việc tạo sản phẩm RAPD giữa các mồi, chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng RAPD với 7 mồi trên cùng một cây (7.12) theo chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất của thí nghiệm 2.
Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mẫu 7.12 với 7 mồi.
(L) ladder, (Pr1) primer 1, (Pr2) primer 2, (Pr5) primer OPA5, (H8) primer RAH8, (C10) primer OPAC10,( Pr9) primer 9, (Pr10) primer OPA10.
Từ kết quả điện di trên hình 4.11, chúng tôi nhận thấy:
Primer 1: mẫu 7.12 có 4 band (300 bp, 430 bp, 550, bp, 650 bp). Primer 2: mẫu 7.12 có 2 band (350 bp, >1000 bp).
Primer RAH8: mẫu 7.12 có 3 band (380 bp, 620 bp, >1000 bp) và một vài band mờ, khó xác định.
Primer OPAC10 tạo nhiều band, band sáng rõ và đậm, phân tách tốt hơn so với các mồi khác. Mẫu 7.12 có 5 band (400 bp, 520 bp, 800 bp, 1000 bp, >1000 bp).
Primer OPA5, primer 9 và primer OPA10 không có sản phẩm.
Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tôi rút ra nhận xét: Đối với các mồi OPA5, 9, OPA10 đã không tạo sản phẩm RAPD, điều này không thể hiện đƣợc bản chất của kỹ thuật RAPD là cho nhiều band với khả năng nhân bản lớn do sử dụng primer ngẫu nhiên. Vì vậy có thể tiến hành thêm nhiều khảo sát khác để có những khi kết quả phân tích RAPD đối với ba mồi trên chính xác hơn.
Từ những kết quả thu đƣợc của thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2, chúng tôi quyết định sử dụng primer OPAC10 với chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất trong thí nghiệm 1 để thực hiện phản ứng RAPD cho tất cả mẫu ly trích đạt tiêu chuẩn.
Tuy nhiên, để có kết quả phản ứng RAPD tốt hơn thông qua việc thay đổi nồng độ mồi tăng khả năng tạo nhiều sản phẩm khuếch đại, nhằm thu đƣợc band sáng rõ, giúp cho việc xây dựng cây di truyền đạt đƣợc độ chính xác cao.
4.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ OPAC10
Hình 4.12 Kết quả điện di khảo sát nồng độ Primer OPAC10 trên mẫu 2B.14, 7.12.
Theo kết quả điện di hình 4.12, thì nồng độ mồi 0,6 pmol / l và 0,8 pmol / l các band rất mờ và không phân tách rõ. Với nồng độ 1 pmol / l, số lƣợng band nhiều hơn, sáng hơn hai nồng độ trên nhƣng các band vẫn chƣa phân tách rõ ràng. Với nồng độ 1,2 pmol / l thì sản phẩm RAPD cũng có khá nhiều band, đồng thời các band đã có sự phân tách rõ hơn, dễ dàng xác định số band sản phẩm RAPD hơn các nồng độ khác, giúp xây dựng cây di truyền đạt kết quả tốt hơn. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định vẫn sử dụng nồng độ primer 1,2 pmol / l.