Hình 4.5 Kết quả điện di 12 mẫu ly trích theo quy trình 3.
Hình 4.6 Kết quả điện di 13 mẫu ly trích theo quy trình 3.
DNA mẫu thu đƣợc từ quy trình 3 khá tốt. Những mẫu đủ tiêu chuẩn thực hiện phản ứng RAPD là những DNA tạo band sáng rõ, ít bị gãy và tạp khi điện di. Kết quả OD của 25 mẫu này dao động từ 1,48 (mẫu 33) đến 2,43 (mẫu 2B.15), trung bình là 1,86. Tỷ lệ OD trung bình trên 20 mẫu thực hiện phản ứng RAPD tốt là 1,95. Đối với những mẫu thực hiện phản ứng RAPD không thành công, tỷ lệ OD trung bình 1,36 biến thiên trong khoảng 1,1 (mẫu 11.7) đến 1,75 (mẫu 11.2), tuy có vài mẫu kết quả OD tƣơng đối cao (mẫu 11.2: 1,75), nhƣng nhìn chung kết quả này rất thấp. Những mẫu này là những mẫu lá trƣởng thành, lá già. Hơn nữa, việc bảo quản mẫu không tốt, số lá thu đƣợc trên một cây bị hạn chế, lƣợng DNA bị mất dần theo thời gian bảo quản. Tất cả đều đƣợc thu thập từ những cây có lá vàng, nhiều sâu và cây ốm yếu.
Từ những kết quả thu đƣợc, chúng tôi quyết định ly trích DNA theo quy trình 3 và bảo quản mẫu ở - 20 0C, hạn chế lấy mẫu ra khỏi nơi bảo quản nhằm ổn định chất lƣợng DNA để thực hiện kỹ thuật RAPD.
Trong quá trình hoàn thiện quy trình ly trích, chúng tôi nhận thấy: Mẫu đƣợc nghiền trong nitơ lỏng tốt hơn mẫu nghiền trong EB.
Tăng thời gian ủ mẫu và ly tâm trƣớc khi cho Chloroform : Isoamyl alcohol nhằm loại bỏ đƣợc phần lớn chất thứ cấp trong lá Đƣng giúp các hóa chất tăng khả năng hoạt động.
Khi đã cho Chloroform : Isoamyl alcohol không nên vortex mà chỉ đảo nhẹ để tránh làm đứt gãy DNA.
Những bƣớc lấy dịch nổi không nên để đầu tip chạm vào phần tạp (protein) ngăn cách 2 pha, cũng cần tránh hút quá mạnh vì tạp sẽ bị hút lên, ảnh hƣởng đến độ tinh sạch của DNA.
Không để khô cặn quá lâu sẽ làm hỏng DNA.
Không chọn lá quá non (đọt) vì lá còn non đang trong thời kỳ sinh trƣởng mạnh, chứa nhiều hợp chất thứ cấp ảnh hƣởng đến tác dụng của hóa chất. Ngoài ra, lá non chứa nhiều nƣớc nên lƣợng DNA trong lá non ít hơn lá trƣởng thành. Đồng thời cũng không chọn lá già. Bởi vì polysachride trong lá già tạo nhớt, ảnh hƣởng đến chất lƣợng ly trích qua các thao tác hút dịch nổi, đổ bỏ dịch trong gây thất thoát DNA mẫu. Nên sử dụng lá non (liền kề với đọt) sẽ cho kết quả ly trích tốt hơn. Để khắc phục việc chọn mẫu lá non, chúng ta có thể tăng nồng độ các hóa chất có tác dụng làm kết tủa protein, peptide, polyphenol nhƣ CTAB, - mercaptroethanol, chloroform và tăng lƣợng mẫu lá khi nghiền. Đối với lá già thì cho thêm PVP (Polyvinyl pyrrolidone) vào sẽ giúp hạn chế đƣợc ảnh hƣởng của polyscharide (tạo nhớt), sản phẩm ly trích ít có tạp hơn so với hai quy trình trƣớc, dịch nhớt cũng đã giảm đáng kể.
Nên trữ mẫu DNA ở - 20 0C nhằm hạn chế sự mất dần lƣợng DNA.
Dịch trích EB khi bảo quản thƣờng có hiện tƣợng kết tủa (CTAB) ảnh hƣởng
đến kết quả ly trích DNA, do đó cần ủ dung dịch EB ở 650 C khoảng 10 phút trƣớc khi sử dụng. Khi hút dịch trích nên khuấy đều dung dịch, để các thành phần hóa chất trong EB nhƣ nhau trong các lần hút.
Quy trình ly trích đã sử dụng - mercaptoethanol trong dung dịch EB, có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào tăng khả năng giải phóng DNA, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA và việc sử dụng Chloroform : Isoamyl acohol 2 lần, ly tâm tốc độ cao đã giúp loại bỏ đƣợc tạp chất nhƣ protein, polysaccharide, và một số hợp chất thứ cấp khác. Nhìn chung quy trình ly trích cải tiến, nghiền trong nitơ lỏng và sử dụng PVP (Polyvinyl pyrrolidone) khá ổn định và hiệu quả.