a. Thiết bị và dụng cụ
Chày và cối (Đức). Pippet các loại (Nichiry - Nhật Bản).
Lò Viba (Electrolux). Eppendorf 1,5 ml (Pháp).
Đầu típ các loại (Đức). Tủ lạnh 4oC và -20oC (Sanyo - Nhật Bản).
Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức).
Máy Vortex (IKA – Thụy Điển). Máy điện di (Biorad - Thụy Điển).
Tủ hút (Việt Nam). Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ).
Tủ cấy vô trùng (Anh). Tủ sấy (Jencons - Anh).
Bồn ủ nhiệt (Memmert - Anh). Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản).
Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad - Thụy Điển).
b. Hóa chất ly trích
EB. Sodium acetate.
Chloroform : Isoamylalcohol. Ethanol 70 %, 100 %.
3.3.1.2. Quy trình ly trích DNA
a. Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) gồm 11 bƣớc (đã bỏ qua bƣớc thêm RNase)
Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ (14.000 vòng / phút). Ủ ở 650 C trong 45 phút.
Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, ly tâm 5 phút 14.000 vòng ở 10 0C. Thu 350 l dịch nổi.
Bƣớc 3: Lặp lại bƣớc 2. Thu 250 l dịch nổi.
Bƣớc 4: Thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200 C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).
Bƣớc 5: Ly tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 6: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370
C trong 1h.
Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn
đều và để – 20 0C trong 30 phút.
Bƣớc 8: Ly tâm 10 phút 14.000 vòng ở 10 0C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng ở 10 0C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 30 phút.
Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở - 20 0C.
b. Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến thứ nhất gồm 12 bƣớc
Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô. Thêm 1,8 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng / phút). Ủ ở 65oC trong 1h.
Bƣớc 2: Ly tâm 10.000 vòng trong 30 phút ở 4 0C. Thu 700 l dịch nổi.
Bƣớc 3: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 9.800 vòng trong 10 phút ở 4 0 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3. Thu 300 l dịch nổi.
Bƣớc 5: Thêm 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở - 20 0C qua đêm. Bƣớc 6: Ly tâm 9.800 vòng trong 10 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa trắng.
Bƣớc 7: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1h.
Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn
đều. Ủ – 20 0
C trong 1 h.
Bƣớc 9: Ly tâm 5.000 vòng trong 20 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 5.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn ở 37 0
C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X, ủ ở 37 0
C trong 1 h.
Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu ở - 20 0C.
c. Quy trình 3: Quy trình ly trích cải tiến thứ 2 gồm 12 bƣớc
Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô. Nghiền trong nitơ lỏng. Thêm 1,2 ml dịch trích EB (có thêm PVP – Polyvinyl pyrrolidone, trong 100 ml EB sử dụng 2 g PVP), vortex kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng / phút) đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ ở 65 0C trong 1h.
Bƣớc 2: Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Thu 700 l dịch nổi.
Bƣớc 3: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Thu 500 l dịch nổi.
Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3. Thu 300 l dịch nổi.
Bƣớc 5: Thêm 200 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở - 20 0C qua đêm. Bƣớc 6: Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa trắng.
Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn đều. Ủ – 20 0C trong 1 h.
Bƣớc 9: Ly tâm 11.000 vòng trong 25 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 12.000 vòng trong 3 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn ở 37 0C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1 h.
Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở - 20 0C.