2.9.3.1. Khái niệm
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. [1], [3], [7], [15]
Các bƣớc tiến hành kỹ thuật RAPD Bƣớc 1: Tách chiết DNA.
DNA đƣợc tách chiết có chất lƣợng tốt, tƣơng đối sạch và không bị gãy (smear) nhiều. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA:
DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. Có RNA trong mẫu DNA.
WSSP/StudentScholars/project/archives/onions/rapd1.gif
Hình 2.8 Nguyên lý kỹ thuật RAPD. [78]
1, 2, 3, 4, 5, 6: mồi.
(A) sản phẩm khuếch đại đoạn DNA được giới hạn giữa 2 mồi 2 và 5. (B) sản phẩm khuếch đại đoạn DNA được giới hạn giữa 2 mồi 3 và 6.
Có polyphenol trong mẫu DNA.
Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác.
Bƣớc 2: Điện di phát hiện. Kết quả PCR – RAPD đƣợc điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.
Bƣớc 3: Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram), các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.
Đoạn DNA đƣợc khuếch đại thƣờng có kích thƣớc dƣới 1.000 bp. Đó là lý do đoạn DNA đƣợc giới hạn giữa 2 mồi 1 và 4 không đƣợc khuếch đại.
Một số vấn đề thƣờng gặp khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR:
Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên bảng gel điện di. Nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng.
Taq - polymerase đƣợc cung cấp từ các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau. Vì vậy, nồng độ và thời gian sử dụng tối ƣu của mỗi loại Taq đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm.
Kết quả không ổn định: cùng 1 mẫu DNA, cùng 1 thành phần hóa chất nhƣng
mỗi lần thực hiện khác nhau có thể cho kết quả khác nhau.