3.1.1. Thời gian thực hiện
Đề tài đƣợc thực hiện từ 7 tháng 5 năm 2007 đến 31 tháng 8 năm 2007.
3.1.2. Địa điểm thực hiện
Thu thập mẫu tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. Phân tích di truyền tại trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2.Vật liệu thí nghiệm
36 mẫu lá Đƣng đƣợc thu thập tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
3.2.1. Nguyên tắc thu thập mẫu
Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trên bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).
Thu thập lá của cây Đƣng (lá già, lá non, lá trƣởng thành).
Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác nhau nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị bệnh.
3.2.2. Cách ký hiệu mẫu
Mẫu đƣợc đặt tên xx.yy với xx là tiểu khu, yy là thứ tự của mẫu.
Ví dụ: 7.12 là mẫu thứ 12 thu thập ở tiểu khu 7, 2B.14 là mẫu thứ 14 thu thập ở tiểu khu 2B, hay 27 là mẫu thứ 27 thu thập đƣợc ở tiểu khu 10.
3.2.3. Cách lấy mẫu
Chọn những lá tƣơi tốt, thu thập lá non, lá trƣởng thành và lá già. Mỗi mẫu lấy khoảng 2 - 3 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá. Đồng thời ghi những thông tin về cây: tọa độ, chiều cao thân cây, đƣờng kính thân, cây có nhiều sâu hay xanh tốt, cây mọc tự nhiên hay trồng. Mẫu đƣợc thu thập trên đƣờng thủy (26 mẫu: từ mẫu thứ 1 đến 26 thuộc các tiểu khu 1, 2, 7, 11, 12) và đƣờng bộ (10 mẫu: từ mẫu thứ 27 đến 36, thuộc tiểu khu 10). Khoảng cách trung bình giữa 2 mẫu thu thập là 500 m.
3.2.4. Cách bảo quản mẫu
Mẫu lá tƣơi sau khi thu thập sẽ đƣợc đem về phòng thí nghiệm và bảo quản ở 40 C.
3.3.Phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1. Quy trình ly trích DNA 3.3.1. Quy trình ly trích DNA
3.3.1.1. Vật liệu dùng trong ly trích DNA a. Thiết bị và dụng cụ a. Thiết bị và dụng cụ
Chày và cối (Đức). Pippet các loại (Nichiry - Nhật Bản).
Lò Viba (Electrolux). Eppendorf 1,5 ml (Pháp).
Đầu típ các loại (Đức). Tủ lạnh 4oC và -20oC (Sanyo - Nhật Bản).
Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức).
Máy Vortex (IKA – Thụy Điển). Máy điện di (Biorad - Thụy Điển).
Tủ hút (Việt Nam). Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ).
Tủ cấy vô trùng (Anh). Tủ sấy (Jencons - Anh).
Bồn ủ nhiệt (Memmert - Anh). Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản).
Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad - Thụy Điển).
b. Hóa chất ly trích
EB. Sodium acetate.
Chloroform : Isoamylalcohol. Ethanol 70 %, 100 %.
3.3.1.2. Quy trình ly trích DNA
a. Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) gồm 11 bƣớc (đã bỏ qua bƣớc thêm RNase)
Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ (14.000 vòng / phút). Ủ ở 650 C trong 45 phút.
Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, ly tâm 5 phút 14.000 vòng ở 10 0C. Thu 350 l dịch nổi.
Bƣớc 3: Lặp lại bƣớc 2. Thu 250 l dịch nổi.
Bƣớc 4: Thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200 C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).
Bƣớc 5: Ly tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 6: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370
C trong 1h.
Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn
đều và để – 20 0C trong 30 phút.
Bƣớc 8: Ly tâm 10 phút 14.000 vòng ở 10 0C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng ở 10 0C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 30 phút.
Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở - 20 0C.
b. Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến thứ nhất gồm 12 bƣớc
Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô. Thêm 1,8 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng / phút). Ủ ở 65oC trong 1h.
Bƣớc 2: Ly tâm 10.000 vòng trong 30 phút ở 4 0C. Thu 700 l dịch nổi.
Bƣớc 3: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 9.800 vòng trong 10 phút ở 4 0
Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3. Thu 300 l dịch nổi.
Bƣớc 5: Thêm 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở - 20 0C qua đêm. Bƣớc 6: Ly tâm 9.800 vòng trong 10 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa trắng.
Bƣớc 7: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1h.
Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn
đều. Ủ – 20 0
C trong 1 h.
Bƣớc 9: Ly tâm 5.000 vòng trong 20 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 5.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn ở 37 0
C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X, ủ ở 37 0
C trong 1 h.
Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu ở - 20 0C.
c. Quy trình 3: Quy trình ly trích cải tiến thứ 2 gồm 12 bƣớc
Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô. Nghiền trong nitơ lỏng. Thêm 1,2 ml dịch trích EB (có thêm PVP – Polyvinyl pyrrolidone, trong 100 ml EB sử dụng 2 g PVP), vortex kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng / phút) đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ ở 65 0C trong 1h.
Bƣớc 2: Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Thu 700 l dịch nổi.
Bƣớc 3: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Thu 500 l dịch nổi.
Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3. Thu 300 l dịch nổi.
Bƣớc 5: Thêm 200 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở - 20 0C qua đêm. Bƣớc 6: Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa trắng.
Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn đều. Ủ – 20 0C trong 1 h.
Bƣớc 9: Ly tâm 11.000 vòng trong 25 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 12.000 vòng trong 3 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn ở 37 0C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1 h.
Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở - 20 0C.
3.3.1.3. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp quang phổ
Dựng đƣờng chuẩn bằng dung dịch TE 1X theo hƣớng dẫn ghi trên máy đo hấp thu quang phổ. Độ pha loãng mẫu 100 lần, ứng với 5 l DNA và 495 l TE 1X.
3.3.1.4. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose gel agarose
Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,15 g agarose cho vào 15 ml dung dịch TAE 0,5X (đối với gel 6 giếng). Đun bằng lò Viba cho agarose tan thật đều.
Đổ gel, chờ agarose đông.
Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 l loading dye và 4 l DNA mẫu.
Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian khoảng 20 phút. Nhuộm ethidium bromide khoảng 15 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel.
3.3.2. Kỹ thuật RAPD
3.3.2.1. Vật liệu dùng trong RAPD a. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm a. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Đầu típ các loại (Đức). Ống eppendorf 200 μl (Pháp).
Giếng đổ gel. Máy điện di (Biorad - Thụy Điển).
Đá gel, bao tay. Tủ lạnh – 200C (Sanyo - Nhật Bản).
Máy PCR Biorad (Biorad - Thụy Điển).
Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad - Thụy Điển).
b. Hóa chất thí nghiệm
Taq DNA polymerase (Promega - Mỹ). Ladder 2. Buffer B. MgCl2. dNTP. Nƣớc siêu sạch. Primer: sử dụng 7 primer:
Primer OPAC10: 5’ AGCAGCGAGG 3’ và Tm = 34 0 C. Primer 1: 5’ TGCCGAGCTG 3’ và Tm = 40,7 0 C.
Primer 2: 5’ AGTCAGCCAC 3’ và Tm = 34,3 0 C. Primer OPA05: 5’AGGGGTCTTG 3’ và Tm = 30,2 oC. Primer RAH8: 5’ GAGAGCCAAC 3’ và Tm = 31,9 0 C. Primer 9: 5’ GGTACTCCCC 3’ và Tm = 33,9 0 C.
3.3.2.2. Tiến hành thí nghiệm
a. Thí nghiệm 1: Sử dụng primer OPAC10, khảo sát quy trình RAPD với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2.
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1.
Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2
Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3
Taq DNA polymerase 5 U 1 U 5
DNA 20 ng / l 1
H2O 13
Tổng thể tích phản ứng 25 l
Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1.
Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 5 phút 40 94 30 giây 36 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút
Ổn định 40 C
b. Thí nghiệm 2: Khảo sát 7 mồi trên cây Đƣng cùng một số cây ngập mặn khác, với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và bảng 3.4.
Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2.
Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối
Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2
Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3
Taq DNA polymerase 5 U 1 U 5
DNA 20 ng / l 1
H2O 13
Tổng thể tích phản ứng 25 l
Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2.
Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 5 phút 40 94 30 giây Ta= Tm ± X 0C (2 < X < 4) 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút Ổn định 40 C
Ta: nhiệt độ của phản ứng PCR. T m: nhiệt độ nóng chảy của mồi.
Nhiệt độ phản ứng PCR đối với mỗi mồi
Primer 1: Ta = 38 0C. Primer 2: Ta = 36 0C
Primer OPA5: Ta = 34 0C. Primer 9: Ta = 36 0C.
Primer RAH8: Ta = 34 0C. Primer OPAC10: Ta = 36 0C.
c. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ primer OPAC10 với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.5 và bảng 3.6.
Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3.
Nghiệm thức Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ
cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2
Taq DNA polymerase 5 U 1 U 5
DNA 20 ng / l 1
Nghiệm thức 1 Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3
Nghiệm thức 2 Primer 100 pmol / l 1 pmol / l 0,25
Nghiệm thức 3 Primer 100 pmol / l 0,8 pmol / l 0,2
Nghiệm thức 4 Primer 100 pmol / l 0,6 pmol / l 0,15
H2O Thêm vào cho đủ 25 l.
Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3.
Số chu kỳ Nhiệt độ (0
C) Thời gian
1 94 5 phút
40 36 30 giây
72 1 phút
1 72 5 phút
Ổn định 40 C
d. Thí nghiệm 4: Sử dụng primer OPCA10 thực hiện phản ứng RAPD với các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn, với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.9 và bảng 3.10.
Bảng 3.7: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4.
Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2
Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3
Taq DNA polymerase 5 U 1 U 0,2
DNA 20 ng / l 20 ng / l 1
H2O 17,8
Tổng thể tích phản ứng 25 l
Bảng 3.8: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4.
Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 5 phút
40
94 30 giây
36 30 giây
1 72 5 phút Ổn định 40
C
Một số lƣu ý khi thực hiện phản ứng RAPD
Trong thành phần phản ứng, Taq DNA polymerase đƣợc sử dụng với thể tích rất nhỏ (0,2 l), để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm, thông thƣờng ngƣời ta trộn một lần nhiều phản ứng.
Các thao tác trộn mẫu phải đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng, nhằm tránh sự tạp nhiễm. Trong quá trình trộn mẫu, hóa chất và DNA mẫu phải đƣợc giữ lạnh để tránh hƣ hỏng. Các thao tác trộn mẫu phải tiến hành nhẹ nhàng, tránh tạo bọt dẫn đến thể tích hút không chính xác, các hóa chất trong dung dịch hút không đồng đều.
Taq DNA polymerase phải đƣợc thêm vào sau cùng. Sau khi đã thêm Taq vào hỗn hợp, các thao tác tiếp theo phải đƣợc tiến hành nhanh chóng vì Taq sẽ hoạt động ngay.
Ngoài ra, kết quả phản ứng RAPD còn phụ thuộc một số yếu tố khách quan khác nhƣ: chất lƣợng gel (độ dày của gel không đồng nhất, chiều cao các giếng không đều), điện thế không ổn định hoặc điện cực của máy điện di bị cong và dung dịch điện di.
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.Kết quả thu thập mẫu Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Giờ
Chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 36 mẫu lá Đƣng từ những cây có đặc điểm hình thái khác nhau: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây con, cây mọc tự nhiên, tái sinh hay đƣợc trồng.
Hình 4.1 Vị trí các mẫu Đƣng đƣợc thu thập trên bản đồ Cần Giờ.
Tuy số mẫu thu đƣợc rất ít so với tổng diện tích hơn 38.000 ha (1993 - 1999) của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nhƣng các mẫu có sự phân bố rải rác giữa
hai vùng quan trọng, đó là vùng lõi (tiểu khu 11,12) và vùng đệm (tiểu khu 1, 2, 7, 10). Cách thu thập mẫu ngẫu nhiên cũng giúp kết quả phân tích, đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng tại đây mang tính tổng thể và khách quan hơn.
Đa số nhóm cây Đƣng mọc tự nhiên (22 cây) xanh tốt, có nhiều nhánh, nhiều hoa và trái, ít sâu bệnh. Bên cạnh cây xanh tốt, những cây đƣợc trồng (11 cây) khác đều có lá to, nhiều lá vàng, sâu bệnh. Riêng 3 cây tái sinh thu thập đƣợc đều có lá to và nhiều sâu. Điều này chứng tỏ, cây mọc tự nhiên có sức sống tốt ít bị tác động bởi sâu bệnh, sinh trƣởng mạnh, cho nhiều hoa và trái to, có thể trồng xen vào các quần thể Đƣng đƣợc trồng nhằm tăng hiệu quả tái tạo rừng và đảm bảo tính đa dạng sinh học tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
4.2.Bảo quản mẫu
Mẫu lá Đƣng tƣơi trong điều kiện – 20 0C sẽ nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh. Điều này là do khi trữ ở – 20 0C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá Đƣng. Khi tiếp xúc với nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá Đƣng đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá.
Để khắc phục nhƣợc điểm trên, chúng tôi đề nghị một số giải pháp nhƣ sau: Cách trữ mẫu tƣơi tốt nhất là cho vào trong túi nilông, ép hết không khí trong túi ra ngoài và trữ ở 4 oC. Với cách trữ này, mẫu có thể bảo quản đƣợc trong vòng 15 ngày mà không bị hƣ hỏng khi lấy ra ngoài điều kiện nhiệt độ phòng. Cách khác cắt mẫu lá tƣơi sẵn trƣớc khi nghiền, có thể trữ đƣợc 7 ngày. Tuy nhiên theo cách này, thì mẫu đem ra phải đƣợc nghiền ngay trong nitơ lỏng, vì nếu nghiền trong EB mẫu sẽ nhanh chóng hóa nâu, chất lƣợng ly trích giảm. Lá có màu nâu do các hợp chất phenol tiết ra trong quá trình trữ mẫu tiếp xúc với không khí. Khi nghiền những mẫu này trong nitơ lỏng ở nhiệt độ - 196 0
C, các thành phần có trong lá nhanh chóng đƣợc đông lạnh lại, trong suốt quá trình nghiền mẫu luôn đƣợc tiếp xúc với nitơ lỏng, vì vậy chất lƣợng DNA ly trích đƣợc sẽ tốt hơn. Mẫu lá tƣơi cũng có thể đƣợc