2.9.1.1. Khái niệm
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA đƣợc cắt ra này lai với những probe đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả đƣợc quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao. [7], [9]
RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhƣng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe ngƣời thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lƣợng và chất lƣợng rất cao. Do đó, ngƣời ta có xu hƣớng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase.
Hình 2.6 RFLP trong trƣờng hợp có đột biến điểm. 2.9.1.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP
a. Nghiên cứu lập bản đồ gene
Mc. Couch và ctv (1988) thiết lập bản đồ di truyền nhờ marker phân tử (RFLP) trên cây lúa gồm 135 loci [9], [10]. Bản đồ gồm 12 nhiễm sắc thể (NST) với tổng cộng 1.389 cM trên genome cây lúa từ cặp lai IR34583 (indica) và Bulu Dalam (Javanica).
Ba năm sau, bản đồ thứ hai từ quần thể IRAT117 (Japonica) và Apura (indica) đƣợc công bố (Mc. Couch 1991, Tanksley và ctv 1991).
Saito và ctv (1991) thiết lập một bản đồ khác dựa trên cặp lai Kasalath (indica) và Fl134 (Japonica) với 347 RFLP marker, phủ trên 12 NST với tổng cộng 1.836 cM với 347 loci.
Để phân tích sự đa dạng di truyền của 112 giống lúa ở Châu Á, Takashige và cộng sự (1995) đã sử dụng 12 probe DNA để nghiên cứu và đã xác định đƣợc mối tƣơng quan di truyền giữa các giống lúa nói trên.
Qifa Zhang và cộng sự (1992) đã xác định đƣợc sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa indica (12 dòng) và Japonia (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP.
Yu và cộng sự (1995) cho thấy một số marker hình thái (17 marker, thí dụ nhƣ vỏ trấu màu tím, lá không có lông, hạt gạo nâu, dạng cây lùn) có mối liên kết với marker RFLP.
b. Một số ứng dụng khác
Lập bản đồ gene cho bệnh đạo ôn và các gene kháng bệnh bạc lá, rầy nâu, sâu đục thân.
Marker phân tử trong di truyền và chọn giống. Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể. Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể.
2.9.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) 2.9.2.1. Khái niệm 2.9.2.1. Khái niệm
Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1993) phát minh ra. Sau đó đƣợc Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt bằng RE từ bộ gene của đối tƣợng nghiên cứu. Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 bp. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao. [1], [3], [15], [16]
Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bƣớc cơ bản [24]
Bƣớc 1: Tách chiết DNA. AFLP đòi hỏi DNA phải có độ tinh sạch cao. Bƣớc 2: Cắt giới hạn và gắn adapter. Bƣớc này gồm có hai giai đoạn:
Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn nhờ 2 enzyme cắt. Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ sung với những đoạn DNA vừa đƣợc cắt, để trong 2 phản ứng PCR sau ngƣời ta sử dụng những primer có trình tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn.
Để các đoạn DNA vừa cắt không bắt cặp với nhau, giai đoạn cắt giới hạn và gắn adapter đƣợc xem nhƣ một.
http://www.iowalivingroadway.com/ResearchProjects/images/409b.gif
Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP. [36] Bƣớc 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification).
Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn adapter từ bƣớc 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bƣớc 2 và cộng thêm 1 nucleotide ở đầu 3’.
Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter
MseI + 1 nucleotide (thƣờng là C).
Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter
Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp những đoạn DNA đƣợc cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lƣợng của những đoạn có thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn lọc). Việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt đƣợc nhiều đoạn bổ sung với adapter.
Bƣớc này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %. Bƣớc 4: Nhân bản chọn lọc (Selective amplification).
Thực hiện phản ứng PCR thứ hai sử dụng các primer nhân bản chọn lọc có trình tự tƣơng tự nhƣ primer nhân bản tiền chọn lọc, cộng thêm 2 hay 3 nucleotide ở đầu 3’. Mục đích chính của bƣớc này nhằm chọn lọc tối đa các đoạn DNA đã đƣợc cắt giới hạn và gắn adapter đã đƣợc nhân bản ở bƣớc 3, chỉ nhân bản những đoạn DNA có trình tự 2 đầu hoàn toàn bổ sung với trình tự của các primer nhân bản chọn lọc, qua đó làm giảm nhiều độ phức tạp của kết quả.
Primer nhân bản chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter MseI + 2 hay 3 nucleotide.
Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter
EcoRI + 3 nucleotide + chất phát màu huỳnh quang (giúp phát hiện sản phẩm khi điện di).
Bƣớc 5: Điện di và phân tích kết quả.
Kết quả AFLP có thể đƣợc điện di trên máy giải trình tự gene hay điện di trên gel polyacrylamide.
2.9.2.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật AFLP a. Nghiên cứu đa dạng di truyền a. Nghiên cứu đa dạng di truyền
Sử dụng AFLP để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các giống điều (Anacardium occidentale L.) đang đƣợc trồng ở Đông Nam Bộ (Hồ Bích Liên và ctv., 2006) đã thu đƣợc một số kết quả [7]:
Xác định đƣợc 7 / 64 tổ hợp mồi cho sản phẩm khuếch đại có mức đa hình cao. Tổ hợp primer AM – CTG / E – AGC cho tính đa hình cao nhất (139 / 141 sản phẩm
khuếch đại đa hình) trong tổng số 7 tổ hợp primer đƣợc chọn. Qua phân tích thấy rằng quần thể điều ở 3 tỉnh Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, Đồng Nai có hệ số đồng dạng cao.
Phát hiện đƣợc 17 chỉ thị phân tử có thể cho phép nhận dạng đối với 17 mẫu điều trong số 26 mẫu phân tích và có 21 chỉ thị có liên quan chặt với 10 tính trạng. Đặc biệt, có 4 chỉ thị (kích thƣớc 310 bp, 265 bp, 222 bp,111 bp) liên quan đến màu sắc của hoa và lá.
b. Một số ứng dụng khác
Phân nhóm di truyền: phân nhóm di truyền gene khoai lang (Liu, 1999). Bản đồ gene cloning.
Kỹ thuật “finger printing”. [7], [10]
2.9.3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
2.9.3.1. Khái niệm
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. [1], [3], [7], [15]
Các bƣớc tiến hành kỹ thuật RAPD Bƣớc 1: Tách chiết DNA.
DNA đƣợc tách chiết có chất lƣợng tốt, tƣơng đối sạch và không bị gãy (smear) nhiều. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA:
DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. Có RNA trong mẫu DNA.
WSSP/StudentScholars/project/archives/onions/rapd1.gif
Hình 2.8 Nguyên lý kỹ thuật RAPD. [78]
1, 2, 3, 4, 5, 6: mồi.
(A) sản phẩm khuếch đại đoạn DNA được giới hạn giữa 2 mồi 2 và 5. (B) sản phẩm khuếch đại đoạn DNA được giới hạn giữa 2 mồi 3 và 6.
Có polyphenol trong mẫu DNA.
Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác.
Bƣớc 2: Điện di phát hiện. Kết quả PCR – RAPD đƣợc điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.
Bƣớc 3: Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram), các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.
Đoạn DNA đƣợc khuếch đại thƣờng có kích thƣớc dƣới 1.000 bp. Đó là lý do đoạn DNA đƣợc giới hạn giữa 2 mồi 1 và 4 không đƣợc khuếch đại.
Một số vấn đề thƣờng gặp khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR:
Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên bảng gel điện di. Nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng.
Taq - polymerase đƣợc cung cấp từ các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau. Vì vậy, nồng độ và thời gian sử dụng tối ƣu của mỗi loại Taq đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm.
Kết quả không ổn định: cùng 1 mẫu DNA, cùng 1 thành phần hóa chất nhƣng
mỗi lần thực hiện khác nhau có thể cho kết quả khác nhau.
2.9.3.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD
Về mặt kỹ thuật: RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lƣợng DNA mẫu không cần độ tinh sạch cao, lƣợng DNA cần ít, thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao. [9]
Về mặt kinh tế: chi phí thực hiện thấp, kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao, tạo sự đa hình nhanh. [9]
2.9.3.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD cho kết quả không ổn định, mức độ giống nhau giữa các lần lặp lại thấp. [4], [9]
2.9.3.4. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RAPD
Do tính hiệu quả nên RAPD nhanh chóng có vị trí xứng đáng trong nghiên cứu về sự đa dạng di truyền ở một số giống cây trồng một và hai lá mầm nhƣ lúa, chuối, khoai tây, bắp, dứa, bông cải, đậu nành, cà chua, dâu tây, cacao, cúc lai, cà phê. RAPD đƣợc xem là một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh. [4], [9]
Thái Kỳ Tài và cộng sự (2004) đã phân tích đƣợc tính đa hình 8 giống cà chua (KBT4, giống số 12, SG2.1, SG2.2, F21, F4, M21, M4), đồng thời cũng phân tích sự đa dạng di truyền các locus, sự tƣơng đồng gene và khoảng cách gene.
Hoàng Thị Bích Thủy và cộng sự (2004) đã khảo sát tối ƣu phản ứng RAPD và nghiên cứu tính đa hình DNA thông qua việc sử dụng 9 loại mồi (N1 – N6, P5 – P7)
trên 7 giống (dòng) dứa (Thái Lan có gai, Thái Lan, Lâm Đồng, Trung Quốc 220, Trung Quốc 250, Bình Phƣớc, Đắc Lắc).
Xu L.X và cộng sự (1994) ghi nhận sự đa dạng di truyền của 13 giống lúa nƣớc và lúa cạn qua sử dụng 42 cặp mồi ngẫu nhiên giàu G và C.
2.9.4. So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử phân tử
Việc chọn lựa một kỹ thuật sinh học phân tử để sử dụng phải căn cứ vào nhiều yếu tố, cụ thể nhƣ những ƣu và khuyết điểm của kỹ thuật đó hay tùy thuộc vào tình hình nghiên cứu thực tế, tuy nhiên các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử có thể đƣợc so sánh một cách tƣơng đối [16] theo những tiêu chí sau:
Bảng 2.1: So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử
Các yếu tố chính RFLP AFLP RAPD SSR Allozyme
Số lƣợng thông tin Khả năng đáng tin cậy Độ phân giải
Cách tiến hành Thời gian tiến hành
Thấp Cao Cao Khó Dài Cao Cao Cao Vừa phải Ngắn Cao Biến đổi Vừa phải Dễ Ngắn Cao Cao Cao Khó Dài Thấp Cao Vừa phải Dễ Ngắn
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian thực hiện 3.1.1. Thời gian thực hiện
Đề tài đƣợc thực hiện từ 7 tháng 5 năm 2007 đến 31 tháng 8 năm 2007.
3.1.2. Địa điểm thực hiện
Thu thập mẫu tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. Phân tích di truyền tại trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2.Vật liệu thí nghiệm
36 mẫu lá Đƣng đƣợc thu thập tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
3.2.1. Nguyên tắc thu thập mẫu
Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trên bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).
Thu thập lá của cây Đƣng (lá già, lá non, lá trƣởng thành).
Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác nhau nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị bệnh.
3.2.2. Cách ký hiệu mẫu
Mẫu đƣợc đặt tên xx.yy với xx là tiểu khu, yy là thứ tự của mẫu.
Ví dụ: 7.12 là mẫu thứ 12 thu thập ở tiểu khu 7, 2B.14 là mẫu thứ 14 thu thập ở tiểu khu 2B, hay 27 là mẫu thứ 27 thu thập đƣợc ở tiểu khu 10.
3.2.3. Cách lấy mẫu
Chọn những lá tƣơi tốt, thu thập lá non, lá trƣởng thành và lá già. Mỗi mẫu lấy khoảng 2 - 3 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá. Đồng thời ghi những thông tin về cây: tọa độ, chiều cao thân cây, đƣờng kính thân, cây có nhiều sâu hay xanh tốt, cây mọc tự nhiên hay trồng. Mẫu đƣợc thu thập trên đƣờng thủy (26 mẫu: từ mẫu thứ 1 đến 26 thuộc các tiểu khu 1, 2, 7, 11, 12) và đƣờng bộ (10 mẫu: từ mẫu thứ 27 đến 36, thuộc tiểu khu 10). Khoảng cách trung bình giữa 2 mẫu thu thập là 500 m.
3.2.4. Cách bảo quản mẫu
Mẫu lá tƣơi sau khi thu thập sẽ đƣợc đem về phòng thí nghiệm và bảo quản ở 40 C.
3.3.Phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1. Quy trình ly trích DNA 3.3.1. Quy trình ly trích DNA
3.3.1.1. Vật liệu dùng trong ly trích DNA a. Thiết bị và dụng cụ a. Thiết bị và dụng cụ
Chày và cối (Đức). Pippet các loại (Nichiry - Nhật Bản).
Lò Viba (Electrolux). Eppendorf 1,5 ml (Pháp).
Đầu típ các loại (Đức). Tủ lạnh 4oC và -20oC (Sanyo - Nhật Bản).
Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức).
Máy Vortex (IKA – Thụy Điển). Máy điện di (Biorad - Thụy Điển).
Tủ hút (Việt Nam). Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ).
Tủ cấy vô trùng (Anh). Tủ sấy (Jencons - Anh).
Bồn ủ nhiệt (Memmert - Anh). Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản).
Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad - Thụy Điển).
b. Hóa chất ly trích
EB. Sodium acetate.
Chloroform : Isoamylalcohol. Ethanol 70 %, 100 %.
3.3.1.2. Quy trình ly trích DNA
a. Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) gồm 11 bƣớc (đã bỏ qua bƣớc thêm RNase)
Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ (14.000 vòng / phút). Ủ ở 650 C trong 45 phút.
Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, ly tâm 5 phút 14.000 vòng ở 10 0C. Thu 350 l dịch nổi.
Bƣớc 3: Lặp lại bƣớc 2. Thu 250 l dịch nổi.
Bƣớc 4: Thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200 C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).
Bƣớc 5: Ly tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 6: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370
C trong 1h.
Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn