Đánh giá biến lượng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai

Đánh giá biến lượng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

o0o

-KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ BIẾN LƯỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI

PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007

Sinh viên thực hiện: PHẠM NGỌC CHINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐÁNH GIÁ BIẾN LƯỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI

PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS BÙI MINH TRÍ PHẠM NGỌC CHINH

ThS LẠI VĂN LÂM Khóa: 2003-2007 KS TRẦN THANH

Tháng 08/2007

LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường

Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

TS Bùi Minh Trí, ThS Lại Văn Lâm và KS Trần Thanh đã tận tình hướng dẫn,

giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

KS Vũ Thị Quỳnh Chi đã có những chỉ dẫn, động viên giúp tôi thực hiện tốt khóa

luận này

ThS Lê Mậu Túy/ Trưởng Bộ Môn Giống Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam cùng

các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ Môn Giống/Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam

Những người bạn đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp

Và con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để con được như ngày hôm nay

phần cải thiện kinh tế, xã hội và môi trường Chính vì vậy, công tác cải tiến giống để phục vụ nhu cầu phát triển cây cao su là rất quan trọng Tuy nhiên, sự giới hạn về nguồn gen ở các nước châu Á đã gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao su Để khắc phục trở ngại này hiện nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã đưa nguồn gen cây cao su từ vùng bản địa Amazon vào các chương trình lai tạo giống Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu biến lượng, đặc điểm di truyền của các con lai để tạo nguồn tư liệu giúp cải tiến chương trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon

Những kết quả đạt được:

Primer A18 có 10 băng đa hình (chiếm 83,33%) trong tổng số 12 băng được khuếch đại, primer OPB12 có 11 băng đa hình (chiếm 91,67%) trong tổng số 12 băng được

khuếch đại

lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có giá trị từ 0,522 đến 0,976 Giá trị này cũng có nghĩa là khoảng cách di truyền giữa các con lai trong quần thể biến thiên từ 0,024

đến 0,478 Kết quả này cho thấy quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có biến lượng di truyền khá rộng

- Kết quả phân nhóm di truyền dựa trên dữ liệu RAPD cho thấy chưa có mối liên hệ nào được phát hiện giữa các đặc tính nông học (sinh trưởng hoặc sản lượng) và marker RAPD thông qua 2 primer A18 và OPB12

Qua kết quả trên, bước đầu cho thấy marker RAPD đã phản ánh được biến lượng di truyền trong quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268

Kết quả đề tài góp phần tạo tư liệu nghiên cứu di truyền nhằm nhằm sử dụng

hiệu quả nguồn di truyền Amazone vào chương trình cải tiến giống cây cao su

Hevea

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU 4

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố tự nhiên 4

2.1.2 Sự phân bố và sản xuất cao su trên thế giới 4

2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây cao su 5

2.1.4 Một số đặc điểm di truyền của cây cao su 8

2.1.5 Quá trình cải tiến giống cao su 9

2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ 11

2.2.1 Chỉ thị hình thái 11

2.2.2 Chỉ thị isozyme 11

2.2.3 Chỉ thị DNA 12

2.2.3.1 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 12

2.2.3.2 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 12

2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites) 13

2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) 13

2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 13

2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 14

2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 14

2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU19 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21

3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 22

3.2.1 Thời gian nghiên cứu 22

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 22

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu và ly trích DNA 22

3.3.2 Phương pháp kiểm tra hàm lượng và độ tinh sạch của DNA mẫu 23

3.3.3 Phương pháp khuếch đại DNA 24

3.3.4 Phương pháp điện di sản phẩm DNA sau khi khuếch đại 24

3.3.5 Phương pháp phân tích kết quả 24

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 25

4.1 LY TRÍCH DNA 25

4.1.1 Định tính DNA mẫu bằng phương pháp điện di trên gel agarose 25

4.1.2 Định lượng DNA mẫu bằng phương pháp đo mật độ quang (Optical Density) 26

4.2 KHUẾCH ĐẠI DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD 26

4.3 ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE 27

4.4 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH CỦA CÁC PRIMER 29

4.5 ĐÁNH GIÁ BIẾN LƯỢNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CON LAI 29

4.6 PHÂN NHÓM DI TRUYỀN CÁC CON LAI 34

NTSYSpc: Numercial Taxonomy System OD: Optical density

PCR: Polymerase Chain Reaction

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA SSR: Simple Sequence Repeat (microsatellite) STS: Sequence-Tagged Sites

SSCP: Single – Strand Conformation Polymorphism

Taq: Thermus aquaticus

UPGMA: Unweighted pair group method using arithmetic average UV: Ultra violet

VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam SALB: South American Leave Blight

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Tỷ lệ và nồng độ các hóa chất tham gia phản ứng RAPD 27

Bảng 4.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD 27

Bảng 4.3: Số băng DNA được khuếch đại ở các primer 29

Bảng 4.4: Số băng DNA được khuếch đại của các con lai nghiên cứu 30

Bảng 4.5: Hệ số tương đồng di truyền của các con lai nghiên cứu 31

Bảng 4.6: Hệ số tương đồng di truyền giữa các con lai với mẹ (PB260) và bố (RO44/268) của chúng 32

Bảng 4.7: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở bố và các con lai 33

Bảng 4.8: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở mẹ và các con lai 33

Bảng 4.9: Phân nhóm thành tích sinh trưởng và sản lượng của các con lai 35

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Mô tả phản ứng PCR 16

Hình 4.1: DNA của các dòng vô tính cao su trên gel agarose 1% 25

Hình 4.2-A: Băng DNA của các con lai được khuếch đại với primer A18 28

Hình 4.2-B: Băng DNA của các con lai được khuếch đại với primer OPB12 28

Hình 4.2-C: Băng DNA của các con lai còn lại được khuếch đại với cả 2 primer 29

Hình 4.3: Cây phân nhóm di truyền của các con lai được thiết lập dựa trên cơ sở dữ liệu phân tích RAPD, sử dụng phương pháp phân tích cluster UPGMA 36

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây cao su, Hevea brasiliensis Muell Arg thuộc chi Hevea, họ

Euphorbiaceae có nguồn gốc từ vùng rừng thuộc lưu vực sông Amazon, Nam Mỹ

Vùng sinh thái tự nhiên của cây cao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm (Trần Thị Thúy Hoa, 1998)

Cây cao su là cây công nghiệp có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và góp phần cải thiện kinh tế, xã hội và môi trường Cây cao su là loài cây cung cấp nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp, được xếp sau dầu hỏa, than đá và gang thép Bên cạnh các sản phẩm truyền thống từ mủ cao su, cây cao su còn có khả năng cung cấp một khối lượng gỗ có giá trị kinh tế cao sau chu kỳ kinh doanh Mặt khác, hiện nay cây cao su còn được xem là thành phần trong cơ cấu cây trồng có thể đáp ứng chủ trương phủ xanh đất trống, đồi trọc, tái tạo rừng, cải tạo môi sinh Tuy nhiên, sự giới hạn nguồn gen ở các nước châu Á là yếu tố quan trọng nhất gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao su (Lại Văn Lâm và ctv, 2006) Chính vì vậy, các nước trồng cao su trên thế giới đã cố gắng giải quyết vấn đề này bằng cách di nhập bổ sung nguồn vật liệu giống hoang dại của các loài trong chi

Hevea từ vùng nguyên quán Amazon

Tại Việt Nam từ năm 1997, một số kiểu di truyền Amazon triển vọng đã được đưa vào các chương trình lai tạo giống nhằm mở rộng nguồn gen trong công tác chọn tạo giống cao su (Lại Văn Lâm và ctv, 2006)

Những nghiên cứu về di truyền trên cây cao su có thể giúp cho các nhà chọn giống trong việc chọn bố mẹ, định hướng chương trình cải tiến giống và khả năng sử dụng các chỉ tiêu tuyển non cho nghiên cứu di truyền để phát hiện ngay ở giai đoạn non những dòng vô tính có thể làm bố mẹ tốt (Sherpherd, 1969; Simmonds, 1969; Gilbert và ctv, 1973; Nga và Subramaniam, 1976; Tan, 1987; Tan và ctv, 1979; Kavitha K M và ctv, 1990; Licy J., 1992; Lê M T., 1998; Goncalve và ctv, 1998, 2004; Lại Văn Lâm và ctv trích dẫn, 2006) Bên cạnh đó, một số nghiên cứu di truyền đã được tiến hành trên nguồn gen Amazon để ước lượng các thông số di truyền, đánh giá độ lớn và bản chất của các biến lượng di truyền, định lượng tiến bộ di truyền và dự đoán phương pháp chọn giống tốt nhất (Lại Văn Lâm và ctv trích dẫn, 2006)

Hiện nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã đưa nguồn gen Amazon vào các chương trình lai tạo giống Do đó, vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu biến

tế đó chúng tôi tiến hành thực hiên đề tài “Đánh giá biến lượng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai PB260 x RO44/268 bằng kỹ thuật RAPD”

1.2 MỤC TIÊU – YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu

Đánh giá biến lượng di truyền của các con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 bằng marker RAPD Qua đó cung cấp tư liệu cho chương trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền Amazon

- Đánh giá mối liên hệ giữa marker RAPD và các đặc tính sinh trưởng hoặc sản lượng của các con lai

- Nắm vững kỹ thuật PCR, thao tác chính xác, hạn chế sai sót trong quá trình thực hiện

- Sử sụng thành thạo các phần mềm xử lý thống kê sinh học như: NTSYS-pc, Excel

1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI

Do giới hạn về thời gian nên các nghiên cứu của đề tài chỉ phân tích RAPD dựa trên 2 primer A18 và OPB12

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố tự nhiên

Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg) là một loài thuộc chi Hevea, họ Euphorbiaceae Trong chi Hevea, còn có 9 loài Hevea khác: H benthamiana, H

camargona, H camporum, H guianensis, H nitida, H microphylla, H pauciflora, H rigidifolia và H spruceana Mặc dù tất cả các loài Hevea đều có mủ cao su

nhưng chỉ có loài Hevea brasiliensis là có ý nghĩa về kinh tế và đựợc trồng rộng rãi

nhất Cây cao su mọc tự nhiên ở vùng rừng thuộc lưu vực sông Amazon, Nam Mỹ,

gồm các nước: Brazil, Bolivia, Colombia, Peru, Ecuador, Venezuela, French Guiana, Surinam và Guyana (Trần Thị Thuý Hoa, 1998) Ngoài vùng xuất xứ trên, người ta không thấy cây cao su mọc tự nhiên ở nơi nào khác trên thế giới (Trần Thị Thuý Hoa, 1998)

Vùng sinh thái của cây cao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm, khá đa dạng với lượng mưa trung bình từ 1.500 - 2.000 mm/năm, không có mùa khô hoặc mùa khô

C Trong vùng Amazon, cây cao su phát triển chủ yếu trên nền đất sét giàu dinh dưỡng, có độ pH dao động từ 4,5 - 5,5 với tầng đất canh tác sâu, thoát nước trung bình (Nguyễn Thị Huệ, 1997)

2.1.2 Sự phân bố và sản xuất cao su trên thế giới

Năm 1876 đã mở đầu cho công cuộc phát triển cao su trồng với sự thành công trong việc đưa hạt cao su từ Brazil sang các nước châu Á của Henry Wickham

Từ đó cây cao su đã phát triển rộng rãi ở nhiều vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và một phần nhỏ ở châu Mỹ La tinh (Võ Thị Thu Hà, 1996) Sau năm 1889, các vườn cao su châu Á bắt đầu sản xuất mủ, sản lượng mủ cao su ở các nước này nhanh chóng giữ vị trí chủ đạo, đứng đầu là Thái Lan Theo thống kê năm 2002, tổng diện tích cao su trên toàn thế giới khoảng 9 triệu ha và sản lượng khoảng 7,4 triệu tấn, trong đó các nước châu Á chiếm khoảng 94% tổng sản lượng, gồm các nước: Thái Lan (28,7%), Indonesia (24,9%), Malaysia (16,9%), Ấn Độ (10%), Trung Quốc (6,1%), Việt Nam (3,3%), Srilanka (2,1%), các nước châu Á khác (2,1%), châu Phi chiếm khoảng 4,4% và châu Mỹ là 1% tổng sản lượng cao su trên thế giới Năng suất cao su trung bình biến thiên từ 1.500 - 1.800 kg/ha/năm tuỳ thuộc vào trình độ ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật và quản lý của từng quốc gia trồng cao su (Phạm Hải Dương, 2002)

Đến năm 2005, tổng diện tích cao su Việt Nam đạt khoảng 480.200 ha, tổng sản lượng đạt 468.600 tấn, năng suất bình quân đạt 1.480 kg/ha/năm, trong đó bình quân năng suất của Tổng Công ty Cao su Việt Nam là 1.728 kg/ha (Trần Thị Thúy Hoa, 2006)

2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây cao su

Cây cao su là loài đại mộc, trong tự nhiên có thể sống đến 100 năm và cao từ

1,5 m Tuy nhiên, trên các vườn sản xuất, mức độ sinh trưởng của cây cao su bị hạn chế, ít khi cao hơn 25 m, vòng thân khoảng 1 - 1,2 m do mật độ trồng dày, lại bị khai thác mủ liên tục và thường bị cưa đốn để tái canh sau 25 - 30 năm

Cây cao su có 3 lá chét, hoa nhỏ màu vàng, đơn tính đồng chu với tỷ lệ hoa đực gấp 60 lần hoa cái, thụ phấn chéo và tự thụ đều có thể xảy ra, quả có 3 mảnh vỏ chứa 3 hạt, quả tự khai, hạt khá lớn với kích thước khoảng 2 cm, trong hạt có chứa nhiều dầu, dễ mất sức nẩy mầm Khi trên 4 - 5 tuổi, cây cao su bắt đầu ra hoa sau thời kỳ thay lá Ở Việt Nam, vụ hoa vào khoảng tháng 2 – 3 hàng năm, có khi rải rác trong tháng 4 – 6 Trong tự nhiên, cây cao su thụ phấn nhờ gió và côn trùng Tỷ

lệ đậu trái trong tự nhiên rất thấp – dưới 3%, có thể sự cạnh tranh dinh dưỡng và nước làm trái non rụng nhiều (Võ Thị Thu Hà, 1996; Trần Thị Thuý Hoa, 1998)

Cây cao su có thời kỳ qua đông, lá rụng hoàn toàn sau đó nảy lộc phát triển bộ lá mới Cây thay lá sớm hay muộn, từng phần hay toàn phần phụ thuộc vào đặc tính của giống và điều kiện môi trường Trong điều kiện Việt Nam, cây rụng lá qua đông vào khoảng giữa tháng 12 và tháng 2, ở Tây Nguyên và Miền Trung cây rụng lá qua đông sớm hơn Sau đó cây ra hoa vào tháng 3, trái rụng trong tháng 8 - 9 hàng năm Ở độ tuổi 7 – 8, rễ cọc phát triển sâu đến 2,4 m, rễ hút tập trung chủ yếu ở tầng đất từ 0 – 30 cm; rễ bàng cao su phát triển rất rộng, tối đa lên đến 10 – 15 m; ở cây trưởng thành, bộ rễ có thể chiếm đến 15% tổng sinh khối của cây (Võ Thị Thu Hà, 1996; Nguyễn Thị Huệ, 1997)

điều kiện nhiệt độ thấp hơn sẽ làm cho cây phát triển chậm, thời gian kiến thiết cơ

khô lá và chết chồi non, trong trường hợp nghiêm trọng cây có thể chết hoàn toàn Lượng mưa tối thiểu cần cho cây sinh trưởng và phát triển bình thường là 1.500 mm/năm, lượng mưa phân bố đều trong năm thì cây sẽ phát triển tốt nhất; ngược lại, lượng mưa phân bố không đều trong năm sẽ ảnh hưởng lớn đến sản lượng Bên cạnh đó, điều kiện khô hạn sẽ gây tác hại rất lớn đối với cây cao su ở giai đoạn non Tuy nhiên, sức chịu đựng khô hạn ở cây cao su sẽ tốt hơn khi cây ở giai đoạn trưởng thành Mặt khác, độ cao cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cao su Thông thường, cây cao su sẽ phát triển tốt ở độ cao dưới 200 m, độ cao càng lớn cây càng chậm sinh trưởng phát triển, thời gian kiến thiết cơ bản kéo dài hơn Cây cao su ưa đất hơi chua (pH đất thích hợp từ 4,5 - 5,5) Yêu cầu hóa tính đất cho việc trồng cao su không khắt khe nhưng lý tính đòi hỏi phải tốt, tầng đất dày, không úng và địa hình ít dốc là tốt nhất Cây cao su phát triển bình thường ở nơi có tối thiểu 1600 giờ nắng/năm, phát triển tốt ở điều kiện gió nhẹ (vận tốc gió khoảng 3 m/s), nếu vận tốc gió lớn hơn 17 m/s cây bị gãy thân, cành Nếu tốc độ gió lớn hơn 25 m/s cây sẽ gãy thân và lật gốc Mức độ thiệt hại do

gió phụ thuộc vào đặc tính di truyền giống và kỹ thuật canh tác Tuy nhiên, nhờ những thành công trong công tác tuyển chọn giống và các biện pháp nông học, hiện nay cây cao su đã và đang phát triển ra ngoài vùng truyền thống với độ cao lớn, vĩ độ lớn

Mủ cao su là sản phẩm chính được thu hoạch, hình thành từ các sản phẩm của quang hợp Mủ cao su hiện diện trong nhiều bộ phận của cây, nhưng quan trọng nhất là ở các vòng ống mủ nằm trong vỏ thân Khi khai thác, các vết cắt làm đứt hệ thống ống mủ và cao su chảy ra ngoài, sau vài giờ sẽ ngưng lại Dòng mủ sẽ tiếp tục chảy với sản lượng tương đương ở lần cạo kế tiếp cách ít nhất một ngày đến vài ngày Khả năng tái sinh mủ cao su phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính di truyền giống

Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của cây cao su được chia làm 2 giai đoạn chính:

- Thời kỳ chưa trưởng thành (giai đoạn kiến thiết cơ bản): giai đoạn này bắt đầu từ khi trồng đến khi khai thác mủ (vòng thân đo cách mặt đất 1m đạt khoảng 50 cm) Tốc độ sinh trưởng của cây trong giai đoạn này là rất nhanh, kích thước vòng thân có thể tăng 7 – 10 cm/năm Cây chuyển sang thời kỳ trưởng thành khi hoa xuất hiện sau 5 - 6 tuổi Thông thường, giai đoạn kiến thiết cơ bản của cây cao su từ 5 - 7 năm, tùy thuộc vào đặc tính của giống, điều kiện chăm sóc và điều kiện môi trường - Thời kỳ trưởng thành (giai đoạn kinh doanh): là giai đoạn khai thác mủ, thông thường giai đoạn này kéo dài khoảng 20 - 30 năm cho đến khi cưa đốn do hiệu quả kinh tế giảm Diễn biến sản lượng mủ tùy thuộc vào đặc tính giống và điều kiện canh tác, phần lớn các giống sẽ cho năng suất cao nhất ở tuổi trung niên khi cây ở độ tuổi từ 15 – 30, sau đó năng suất giảm rất nhanh do mật độ cây khai thác giảm vì bệnh, gãy đổ, sức sản xuất kém, vỏ khó cạo Trong giai đoạn này, tốc độ sinh trưởng của cây cao su chậm lại, vanh thân chỉ tăng 2 – 5 cm/năm Ở cây cao su, hiện tượng thay lá xuất hiện hàng năm khi cây trên 4 tuổi, lá cũ rụng toàn bộ hoặc từng phần trong khoảng một tháng, sau đó lá mới xuất hiện và ổn định trong khoảng

1 - 1,5 tháng Trong thời gian thay lá, sản lượng mủ sẽ giảm mạnh khi lá non mới mọc (Trần Thị Thúy Hoa,1998)

Về bệnh hại, cây cao su bị trên 550 loài vi sinh vật tấn công, trong đó 24 loài có ảnh hưởng nghiêm trọng về phương diện kinh tế Ngoại trừ bệnh cháy lá Nam

Mỹ – SALB (South American Leave Blight) – do nấm Microcylus ulei gây ra chỉ

xuất hiện ở Nam Mỹ, cây cao su Việt Nam bị gây hại bởi một số bệnh hại chính như bệnh phấn trắng, bệnh nấm hồng, bệnh héo đen đầu lá, bệnh rụng lá mùa mưa, loét sọc miệng cạo.(Võ Thị Thu Hà trích dẫn, 1996)

Trong tự nhiên cây cao su nhân giống bằng hạt Trong điều kiện kinh doanh, cây cao su được nhân giống vô tính bằng phương pháp ghép mắt cửa sổ

2.1.4 Một số đặc điểm di truyền của cây cao su

Đặc điểm chung của các loài thuộc chi Hevea là có cùng số nhiễm sắc thể 2n

= 36 Một số tác giả cho rằng cây cao su là một dạng tứ bội với số lượng nhiễm sắc thể cơ bản n = 9 vì số nhiễm sắc thể của cây cao su gấp đôi các loài khác thuộc họ Euphorbiaceae Các nghiên cứu điện di enzyme cho thấy cây cao su không phải là đồng tứ bội thể mà có lẽ là dị tứ bội thể có tính thích ứng gần giống dạng nhị bội (Trần Thị Thuý Hoa trích dẫn, 1998) Ở cây cao su, các tính trạng kinh tế chính như sinh trưởng, sản lượng mủ, khả năng kháng bệnh… đều do những tính trạng đa gen qui định, di truyền theo phương thức tác động cộng hợp

Cây cao su có hoa đơn tính đồng chu, hoa cái và hoa đực phân bố trên cùng một chùm hoa Ở cây cao su, thụ phấn chéo chiếm ưu thế hơn so với tự thụ, do đó tỷ lệ dị hợp tử cao hơn so với đồng hợp tử Do là cây giao phấn chéo và nhân giống vô tính dễ dàng nên phương pháp cơ bản để cải tiến giống cao su là cho lai giữa hai cha mẹ dị hợp tử để tạo ra các con lai F1, sau đó sẽ tiến hành chọn lọc một số cá thể F1 xuất sắc để tạo thành những dòng vô tính đồng đều về kiểu hình và cố định được kiểu gen Cho đến nay, những thử nghiệm lai hoa nhân tạo giữa các loài cao su khác nhau cho thấy không có sự cản trở về di truyền Trong thực tế, người ta đã tạo ra

nhiều tổ hợp lai khác loài cho mục đích nghiên cứu cũng như tìm thấy nhiều dạng

lai khác loài Hevea trong tự nhiên (Trần Thị Thuý Hoa, 1998)

2.1.5 Quá trình cải tiến giống cao su

Nguồn hạt do Wickham thu thập ở Brazil chuyển về trồng ở Singapore được xem là thủy tổ của hầu hết diện tích cao su của châu Á và châu Phi hiện nay Trong thời kỳ này cao su được trồng bằng hạt thực sinh không chọn lọc nên sản lượng rất thấp dưới 500 kg/ha (Võ Thị Thu Hà, 1996) Theo báo cáo của Cramer năm 1910, trong vườn cao su thực sinh có sự biến thiên rất lớn về sản lượng giữa các cá thể, qua phân tích sự biến thiên ông nhận thấy khoảng 70% sản lượng của cả vườn cây là từ khoảng 30% số cây trong vườn cung cấp Từ đó ông khuyến cáo chọn lọc cây đầu dòng được trồng từ những hạt thực sinh của những cây cho năng suất cao trên vườn Kết quả thu được từ vườn trồng có chọn lọc đã đưa năng suất bình quân lên 630 – 704 kg/ha (Phạm Hải Dương, 2002) Sau đó các nguyên tắc chọn lọc giống cao su lần đầu tiên đã được công bố tại hội nghị ở Batavia (Indonesia) vào năm 1914 Năm 1917, Van Helten đã thành công trong phương pháp nhân giống vô tính cây cao su bằng kỹ thuật ghép mầm ngủ trên gốc thực sinh Phương pháp này đã mở ra một hướng đi mới trong tạo tuyển giống cao su là tạo các dòng vô tính Qua các giai đoạn tuyển chọn, các dòng vô tính xuất sắc sẽ được khuyến cáo cho sản xuất đại trà

Mục tiêu chung của các nước trồng cao su trong công tác chọn tạo giống là nâng cao sản lượng, đồng thời cải tiến những đặc tính có liên quan đến sản lượng như: sinh trưởng, kháng bệnh, kháng gió,… Những phương pháp cải tiến giống thường được sử dụng trên thế giới bao gồm chọn lọc cây đầu dòng, lai hoa nhân tạo, lai hoa tự do, đột biến và đa bội hóa nhiễm sắc thể Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy in-vitro cũng đã được áp dụng trong việc nhân giống vô tính cây cao su Bên cạnh đó, phương pháp chuyển gen cũng đang được nghiên cúu và ứng dụng tại một số Viện Nghiên cứu Cao su trên thế giới Tuy nhiên, cho đến nay phương pháp lai hoa nhân

tạo vẫn là phương pháp có hiệu quả nhất và được hầu hết các nước trên thế giới áp dụng

Ở Việt Nam, vận dụng những kinh nghiệm nghiên cứu từ Viện Nghiên Cứu Cao su Malaysia, Viện Nghiên cứu Cao su Châu Phi kết hợp với những cải tiến, phương pháp tạo tuyển giống cao su của Việt Nam là lai hoa hữu tính từ cha mẹ có chọn lọc, phương pháp tuyển giống trải qua bốn giai đoạn bao gồm tuyển non, sơ tuyển, chung tuyển và sản xuất thử Cho đến nay công tác cải tiến giống cao su tại Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu nhờ vào việc nghiên cứu, ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật vào các chương trình lai tạo giống mới cũng như bước đầu ứng dụng có hiệu quả một số kỹ thuật sinh học phân tử trong việc hổ trợ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống cao su

Tuy nhiên, công tác giống cao su trên thế giới vẫn còn tồn tại một số vấn đề Nguồn vật liệu giống ban đầu do Wickham sưu tập rất giới hạn về mặt di truyền vì chỉ xuất phát từ một vùng nhỏ so với diện tích phân bố tự nhiên của cây cao su, do đó không đại diện đầy đủ cho nguồn gen của cây cao su (Wycherley, P.R 1968) Nguồn di truyền hạn hẹp này còn bị xói mòn nghiêm trọng vì mục tiêu cải tiến giống chỉ nhằm vào sản lượng mủ Bên cạnh đó, sự cận thân giữa các dòng vô tính vẫn còn tồn tại, khó tránh khỏi giao phối cận huyết ở những chu kỳ kế tiếp Chính vì vậy, việc mở rộng biến lượng di truyền con lai thông qua công tác lai tạo giữa nguồn gen Wickham với nguồn gen hoang dại Amazon cũng như việc tăng cường các nghiên cứu về di truyền phân tử hỗ trợ trong công tác lai tạo giống đã và đang được các Viện Nghiên cứu Cao su thế giới tiến hành nhằm chọn lọc ra các tổ hợp lai tốt, có giá trị cao về mặt di truyền

2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ

2.2.1 Chỉ thị hình thái

mà sự biểu hiện của nó không bị ảnh hưởng do tác động của môi trường, có thể được dùng làm chỉ thị hình thái trong quá trình chọn lọc (Lê Duy Thành, 2000)

Mặc dù chỉ thị hình thái rất tiện lợi, dễ xác định do đo trực tiếp trên kiểu hình nhưng chúng lại có những hạn chế nhất định như cho kết quả sai lệch do tương tác kiểu gen với môi trường, số lượng marker có giới hạn, chỉ ở qui mô hình thái và chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.2.2 Chỉ thị isozyme

Trong nghiên cứu di truyền học phân tử, isozyme là một trong hai loại marker cơ bản Isozyme là chỉ thị sinh hoá, chúng là những enzyme có cùng chức năng xúc tác cho một phản ứng (hoạt tính xúc tác tương tự hoặc giống nhau) nhưng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau Hoạt tính của chúng đặc trưng với một cơ chất và trợ enzyme nhất định Về mặt di truyền có thể chia isozyme thành hai dạng (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997):

- Isozyme đơn gen: các isozyme này chịu sự kiểm soát của một gen, mặc dù chúng chúng đều được hình thành từ chuỗi polypeptide đơn nhưng có thể có các kiểu phân tử khác nhau (do sự khác nhau về thành phần và trật tự các acid amin), và do vậy có thể phân tách chúng bằng điện di

- Isozyme đa gen: các isozyme này được mã hoá bởi hai hay nhiều gen và chúng có thể được phân biệt bằng các đặc điểm hoá miễn dịch hoặc bằng đặc tính enzyme (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997)

2.2.3 Chỉ thị DNA

Là những chỉ thị phân tử DNA được tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử Ngày nay các kỹ thuật sinh học phân tử được phát minh ngày càng nhiều và ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu di truyền học phân tử Nó tạo ra số lượng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme, độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều Ngày càng có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng trong các nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện các chỉ thị liên kết với tính trạng,… Các kỹ thuật này có thể chia ra làm 2 nhóm chính:

- Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR - based) như: RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP, (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

- Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non - PCR based): điển hình là RFLP (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

2.2.3.1 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lượng và kích thước của những đoạn DNA được tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) Sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt toàn bộ bộ gen của những cá thể hay giống được nghiên cứu, sau đó sản phẩm cắt được nhận biết bằng cách lai với những probe phát huỳnh quang Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tượng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

2.2.3.2 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism)

Kỹ thuật này dựa trên giả thuyết: sự khác biệt giữa các DNA do sự thay đổi cấu trúc của dây đơn DNA có cấu trúc hình học khác nhau, làm cho DNA di chuyển trên gel với tốc độ và khoảng cách di chuyển khác nhau Sau khi thực hiện phản ứng

PCR, làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di và nhuộm bạc Kỹ thuật SSCP có quy trình thực hiện khó nhƣng kết quả có độ tin cậy không cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites)

Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, STS là đoạn ngắn DNA giúp phân tích bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: trình tự một đoạn DNA chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu lần và phát hiện qua điện di (Nguyễn Thị Lang, 2002) Kỹ thuật này có nhƣợc điểm là phải biết trình tự gen của đối tƣợng nghiên cứu

2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat)

Nguyên lý của kỹ thuật này là giữa những giống khác nhau có một đoạn DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides đƣợc lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng các primer chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên Điều quan trọng là phải biết đƣợc những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng giống Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu đƣợc dùng để định danh những giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền (Nguyễn Thị Lang, 2002)

2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos phát minh năm 1993, sau đó đƣợc Vos và ctv (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt giới hạn từ bộ gen của đối tƣợng nghiên cứu Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 basepairs Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002)

2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD là đoạn trình tự DNA ngắn, do sự tổng hợp một cách ngẫu nhiên, giúp phân tích bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR Kỹ thuật RAPD sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiếu dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002) Kỹ thuật RAPD cho phép tiến hành nghiên cứu di truyền phân tử mà không cần biết trước về trình tự của chuỗi mã di truyền cần nghiên cứu Một số ưu điểm khác của kỹ thuật RAPD là: cho kết qua nhanh,thời gian để thực hiện phản ứng RAPD chỉ khoảng 14 giờ, cần một số lượng DNA mẫu rất nhỏ (25 ng), Kỹ thuật RAPD có thể dùng để nghiên cứu những trình tự có kích thước nhỏ (10 kb) Tuy nhiên kỹ thuật RAPD lại có nhược điểm là độ chính xác không cao

2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và ctv phát minh năm 1990 được sử dụng rộng rãi nhất trong số các ứng dụng của sinh học phân tử Về thực chất đây là phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của các tế bào (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000)

Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện,

tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán phát hiện mầm bệnh trên người, động vật, thực vật, thực phẩm…(Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000)

Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000)

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000)

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như hình 2.1

Hình 2.1: Mô tả phản ứng PCR.

- Bước 1 (tách sợi đôi DNA, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, ở điều kiện này phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn, thường là ở nhiệt độ 94 - 95 C trong vòng 30 giây đến 1 phút

- Bước 2 (bắt cặp, annealation): trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

- Bước 3 (kéo dài, elongation hay extension): dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Mạch mới được tạo thành từ mạch được kéo dài Nhiệt độ phù hợp cho enzyme polymerase hoạt động là 72 C và thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều

Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm 3 bước như trên được lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lượng DNA được gia tăng theo cấp số nhân Theo tính toán, sau

phẩm được nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide, sau đó tiến hành quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm)

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR bao gồm:

– DNA khuôn: DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch, nhưng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại từ dịch DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thường phương pháp này được áp dụng trong chẩn đoán Lượng DNA được dùng trong phản ứng PCR là một lượng cực nhỏ, khoảng 1 g, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm lượng DNA khuôn xuống còn 100 ng Nếu lượng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không như mong muốn hay còn gọi là dương tính giả hay sản phẩm tạp nhiễm Khuôn DNA có thể được thu nhận từ các mẫu không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần

– Enzyme: Thông thường, DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải

là enzyme chịu nhiệt cao Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq DNA

polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus Ngày nay, nhiều loại

enzyme chịu nhiệt khác nhau đã được phát hiện và đưa ra thị trường với chức năng

hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn như enzyme Tth polymerase từ Thermus

thermophilus, enzyme này hoạt động như một enzyme phiên mã ngược thông qua

DNA

– Primer và nhiệt độ lai: Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:

+ Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược, không có cấu trúc dimer primer do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer

+ Nhiệt độ nóng chảy của primer xuôi và primer ngược không cách biệt quá xa Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng, tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần

+ Các primer phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen

+ Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và primer ngược không được quá lớn, phản ứng PCR tối ưu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb

– Các thành phần khác trong phản ứng PCR:

+ Bốn loại nucleotide thường được sử dụng với nồng độ 200 M/ mỗi loại nucleotide Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dương tính giả hay tạp nhiễm Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

+ Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ tối ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường nồng độ tối ưu này phải được xác định riêng cho từng phản ứng

– Số lượng chu kỳ phản ứng: Số lượng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thường không vượt quá 40 chu kỳ Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm vì những nguyên nhân như sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với primer mà chúng tự bắt cặp với nhau Số chu kỳ còn tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu

như máy luân nhiệt (thermocycler) cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc thoát hơi nước trong quá trình phản ứng Eppendorf sử dụng trong phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000)

2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU

Marker phân tử dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã được sử dụng rộng rãi trên cây cao su gồm có RAPD (Varghese và ctv, 1997; Venkatachalam và ctv, 2002), AFLP (Safiah, 2004) và microsatellites (Seguin và ctv, 2001; Lekawipat và ctv, 2003) Trong đó khả năng nhận dạng di truyền của microsatellites là mạnh nhất (Seguin và ctv, 2001) Tuy nhiên, chi phí cho phân tích microsatellites hiện nay còn khá đắt nên trong giai đoạn đầu nghiên cứu, người ta thường sử dụng RAPD trong phân tích đa dạng di truyền và việc sử dụng nhiều primer được khuyến khích để tăng độ tin cậy khi phân tích RAPD

Do tính chất đồng trội nên các marker phân tử có thể sử dụng để kiểm tra phả hệ của con lai và thiết lập bản đồ gen cây cao su (Seguin và ctv, 2001) Bên cạnh đó, các marker phân tử còn là công cụ hỗ trợ thiết yếu trong việc phân tích QTL cho một số tính trạng nông sinh học trên cây cao su như: tính trạng kháng bệnh SALB