Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm biển ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật RAPD

Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm biển ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật RAPD

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2003 – 2007 SINH VIÊN THỰC HIỆN: LÊ ĐỨC TUÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI MINH TRÍ LÊ ĐỨC TUÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn ba mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài. Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học. Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận. Thầy Bùi Minh Trí, đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu. Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh, chị trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Xin cám ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học. Xin chân thành cảm ơn! LÊ ĐỨC TUÂN iii TÓM TẮT LÊ ĐỨC TUÂN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ. Cây mắm biển (Avicennia marina) là một trong những loài thực vật đặc trƣng sinh sống ở rừng ngập mặn đem lại giá trị kinh tế và môi trƣờng rất cao.Tuy nhiên, những thập niên trở lại đây loài mắm biển có dấu hiệu lụi tàn. Vì vậy việc xây dựng chiến lƣợc phát triển lâu dài đem lại hiệu quả kinh tế và môi trƣờng cao, vấn đề đánh giá tổng quát quỹ gene và mức độ đa dạng của quần thể mắm tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh đƣợc xem là một việc làm cấp thiết. Sau một thời gian thực tập ở Viện Nghiên cứu CNSH và CNMT, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, chúng tôi đã đạt đƣợc kết quả: - Thu thập đƣợc 52 mẫu lá mắm với những đặc điểm hình thái khác nhau. - Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu lá mắm. - Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ lá mắm, ly trích tốt 47/52 mẫu - Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm. Qua thử nghiệm trên ba primer: primer 1 và primer RAH8 và primer OPAC10 thì thấy primer OPAC10 cho sản phẩm thể hiện sự đa dạng về di truyền cao. - Kết quả chạy RAPD với primer 1 chỉ cho 1 band đồng hình kích thƣớc 400 bp cho cả ba loài mắm, giúp xác định đƣợc marker chỉ thị cho loài mắm (Avicenniaceae). - Kết quả chạy RAPD với primer OPAC10 cho trung bình 6 band/mẫu. Số lƣợng band/mẫu không cao nhƣng lại thể hiện rõ sự đa hình giữa các mẫu. Chúng iv tôi thu đƣợc 9 band đa hình chiếm tỷ lệ 90% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 10%. Kết quả phân tích trên phần mềm NTSYS (Numercial Taxonomy System) phiên bản 2.1, 7 mẫu mắm đƣợc khảo sát đƣợc chia làm 2 nhóm chính với khoảng cách phân nhóm là 0,40. Nhóm 1 gồm 4 mẫu: M8, M18, M25, M40. Các cây này có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,67 – 1,00. v MỤC LỤC Chƣơng Trang Trang tựa ii Lời cảm ơn . iii Tóm tắt . iv Mục lục . v Danh sách các chữ viết tắt viii Danh sách các hình . ix Dang sách các bảng x Chƣơng 1 LỜI MỞ ĐẦU . 1 1.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Mục đích, yêu cầu . 2 1.2.1 Mục đích . 2 1.2.2 Yêu cầu . 2 1.2.3 Hạn chế của đề tài . 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học 3 2.1.1 Đa dạng sinh học . 3 2.1.2 Đa dạng di truyền 3 2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền 4 2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ . 4 2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ . 4 2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ rừng ngập măn Cần Giờ . 8 2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 9 2.3 Cây mắm biển 11 vi 2.3.1 Hình thái học . 11 2.3.2 Nơi sống và sinh thái . 12 2.3.3 Phân bố 12 2.3.2. Quy trình ly trích DNA thực vật . 13 2.4.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ 14 2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di 15 2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền 16 2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử 16 2.5.1.1 Chỉ thị hình thái . 17 2.5.1.2. Chỉ thị isozyme . 17 2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA . 18 2.5.2 Kỹ thuật PCR 18 2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR . 18 2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR 19 2.5.2.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR . 21 2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) . 22 2.5.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) . 22 2.5.4.1 Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD 25 2.5.4.2 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD 25 2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 25 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH . 27 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện . 27 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 27 3.1.2 Địa điểm thực hiện 27 3.2 Vật liệu thí nghiệm 27 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 vii 3.3.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA . 27 3.3.2 Quy trình ly trích DNA . 31 3.3.3 Kiểm tra kết quả ly trích DNA 33 3.3.4 Thực hiện kỹ thuật RAPD . 34 3.3.4.1 Dụng cụ và hóa chất dung trong kỹ thuật RAPD 34 3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm . 35 3.4 Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS . 38 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 40 4.1 Kết quả thu thập mẫu mắm tại rừng ngập mặn Cần Giờ 40 4.2 Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA . 41 4.2.1 Bảo quản mẫu 41 4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích . 41 4.3 Kết quả chạy RAPD 43 4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8 với chu kỳ nhiệt 1 43 4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1 với chu kỳ ở Bảng 44 4.3.3 Thí nghiiệm 3 45 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 5.1.1 Kết luận . 48 5.1.2 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 50 PHỤ LỤC 52 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair CNMT: Công Nghệ Môi Trƣờng CNSH: Công Nghệ Sinh Học DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxynucleotide triphosphate E: East EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid EtBt: Ethidium bromide N: North. OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature TE: Tris EDTA. TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA. UNESCO: United Nations Educational Scientific, and Cultural Organization UV: Ultra Violet ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 5 Hình 2.2: Cấu trúc cành, lá và trái Mắm 11 Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR 21 Hình 2.4: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền 25 Hình 4.1: Trái mắm biển(A); Hoa(B) . 41 Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 42 Hình 4.3: Kết quả ly trích theo quy trình 1 44 Hình 4.4: Sản phẩm DNA ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) 44 Hình 4.5: Kết quả PCR ở thí nghiệm 1 45 Hình 4.6: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 2 . 46 Hình 4.7: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 3 . 47 Hình 4.8 : Cây phân nhóm một số cây mắm biển tại khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ 48 [...]... bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trƣờng Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con ngƣời 2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa bàn huyện Cần Giờ, đƣợc hình thành ở hạ... DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD 2 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích  Bƣớc đầu phân tích sự đa dạng di truyền của quần thể mắm từ các mẫu  Hoàn thiện kỹ thuật RAPD trên cây mắm biển  Đánh giá về mặt di truyền quần thể mắm trồng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh  Ứng dụng trong tuyển chọn giống mắm phục vụ cho việc tái tạo rừng ngập mặn. .. lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc quản lý theo hệ thống rừng đặc dụng (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) theo quyết định số 173/CT ngày 29/05/1991 do Chủ tịch Hội đồng Bộ trƣởng phê duyệt thành lập Rừng phòng hộ Môi trƣờng Ủy ban nhân dân Tp Hồ Chí Minh đã phê duyệt dự án đầu tƣ xây dựng Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ. .. 12 và 13 Vùng này đặc trƣng cho các hệ sinh thái rừng trồng và đặc biệt là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc theo các kênh rạch và bìa rừng với đa dạng sinh học cao về thành phần các loài động vật, thực vật, vi sinh vật với cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn Các chức năng chính bao gồm: - Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên - Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn. .. nƣớc ở Việt Nam, trong đó có tới 9 loài qúy hiếm đƣợc ghi trong Sách Đỏ Thế giới [18] 2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc chia làm 3 vùng chính: vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp  Vùng lõi (4.721 ha) Mục tiêu quản lý vùng lõi là bảo tồn đa dạng sinh học, hạn chế các hoạt động của con ngƣời Vùng lõi bao gồm các tiểu khu rừng. .. Mắm biển (Avicennia marina) là một nhóm các loại cây rừng ngập mặn, phân bố rộng khắp trên toàn thế giới trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa triều lên và triều xuống về phía Nam của Bắc chí tuyến [17] Sau 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn vào ngày 21/01/2000 [18] Ở nƣớc ta, cây mắm. .. trường đại học, viện nghiên cứu: Triển khai các đề tài nghiên cứu khoa học, giám sát, đánh giá tác động môi trƣờng, tuyên truyền giáo dục ngƣời dân nâng cao ý thức bảo vệ rừng Ban Quản lý khu dự trữ sinh quyển: Ban quản lý khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ dƣới sự quản lý và chỉ đạo trực tiếp của Ủy ban Nhân dân huyện Cần Giờ và Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn với vai trò và nhiệm vụ điều phối... lở, sa mạc hoá, ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển Mặt khác, các khu rừng mắm là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp HCM, đƣợc sự hƣớng dẫn của TS Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện đề tài “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TRÊN QUẦN THỂ MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ... phổi xanh của Thành phố” với chức năng điều hoà không khí, giảm ô nhiễm và hấp thu CO2 do các hoạt động công nghiệp Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc công nhận là khu rừng phòng hộ từ năm 1991 Ủy ban nhân dân Tp Hồ Chí Minh đã phê duyệt dự án đầu tƣ xây dựng Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ giai đoạn 2002 - 2011 theo Quyết định số 8413/QĐ-UB ngày 12/12/2001 Rừng ngập mặn tập... Thiết lập phƣơng pháp ly trích DNA và bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD thích hợp cho cây mắm biển  Thu thập mẫu lá từ những cây mắm biển có tuổi khác nhau và có đặc điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, có màu sắc trái khác lạ…  Ly trích đƣợc DNA từ mẫu lá mắm với độ tinh sạch cao  Thu thập đƣợc bằng kỹ thuật RAPD  Vẽ cây phân loại loài bằng phần mềm NTSYS . thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa. “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG