Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa cayenne bằng phương pháp rapd

Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa cayenne bằng phương pháp rapd

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ

TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP RAPD

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003-2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHONG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN HỒNG PHONG CN LƯU PHÚC LỢI

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

iii

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

- Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua

- TS Trần Thị Dung và CN Lưu Phúc Lợi đã tận tình hướng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

- TS Lê Đình Đôn đã hướng dẫn và góp ý cho tôi khi tiến hành chủng rệp tại nhà lưới

- CN Hồ Việt Thế và các anh chị phụ trách phòng CNSH thực vật thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh - Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã giúp đỡ trong suốt thời gian ở phòng thí nghiệm

- Chị Tôn Bảo Linh, chị Biện Thị Lan Thanh đã góp ý và giúp đỡ tôi trong quá trình làm đề tài

- Toàn thể lớp CNSH29 đã hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

- Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên để con đạt được thành quả như ngày hôm nay

Tháng 9 năm 2007

Nguyễn Hồng Phong

iv

TÓM TẮT

NGUYỄN HỒNG PHONG – Lớp DH03SH, Đại học Nông Lâm Tp HCM

Đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng

bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phương pháp

RAPD” dưới sự hướng dẫn của TS Trần Thị Dung và CN Lưu Phúc Lợi được thực

hiện tại Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh và khu nhà lưới bảo vệ thực vật khoa Nông học Đại học Nông Lâm Tp HCM

Nội dung nghiên cứu gồm:

Đánh giá đa dạng di truyền các giống dứa Cayenne tại Tp HCM bằng kỹ thuật RAPD

Nuôi rệp sáp và tiến hành lây nhiễm virus PMWaV thông qua vector là rệp sáp

Xác định marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne

Các kết quả thu được:

Kết quả cây phân nhóm di truyền cho thấy giữa nhóm Cayenne và đối chứng Queen có hệ số tương đồng là 0,9 Nhóm dứa Cayenne phân thành 2 nhóm nhỏ: nhóm 1 gồm 2 giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan, nhóm 2 là giống Lâm Đồng Mức tương đồng giữa 2 nhóm khoảng 0,92 Kết quả kiểm tra độ tin cậy bằng phần mềm winboot cho thấy cây phân nhóm di truyền tạo ra là có độ tin cậy cao nhất

Kết quả nuôi rệp sáp cho thấy rệp có thể phát triển tốt trên bí đỏ và trong điều kiện 25-26oC rệp phát triển tốt hơn trong điều kiện 33-34oC

Đã lây nhiễm được bệnh héo đỏ đầu lá lên dứa Cayenne với tỷ lệ 35,66% cây có biểu hiện bệnh

Chưa phát hiện được marker liên kết rõ ràng với kiểu hình kháng bệnh héo đỏ đầu lá

Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city

Cayenne pineapple is an important crop in Ho Chi Minh city for domestic consumption and export But today most varietys have been plant is imports and have many pests, especially wilt disease To develop pineapple industry of this area, its need to research genetic variation of varietys in this area and find the type of wilt resistance In this study, we analysed genetic variation of 3 varietys of Cayenne pineapple in Ho Chi Minh city and found markers associated with wilt resistant trait by using 32 primer RAPD and received these results:

- 6 primers gave DNA polymorphisms in 3 Cayenne varietys and 2 controls OPAC10 have hightest allen number in Cayenne UPGMA and bootstrap analysis on the basis of RAPD data clearly showed that 3 Cayenne varietys belong to two major clusters with 92% similarity The first cluster includes Thailand and China varietys with 98% similarity The Second cluster is Lam Dong variety

- The results of rearing mealybug show that mealybug can grow on pumpkin and the development of mealybug at 25 – 26oC is better than 33 – 34oC

- Two primers gave most DNA polymorphisms in pineapple when analysed genetic variation were used to detect marker associated with wilt resistant trait in Cayenne pineapple But non marker was detected

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về cây dứa 3

2.1.1 Phân loại và nguồn gốc 3

2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa 3

2.2 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị 7

2.2.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị 7

2.2.2 Chỉ thị hình thái 8

vii

2.2.3 Chỉ thị isozyme 8

2.2.4 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA 9

2.2.5 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 10

2.3 Các phương pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài 11

2.4 Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền dứa trên Thế Giới và Việt Nam 12

2.4.1 Nghiên cứu trên Thế Giới 12

2.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 13

2.5 Bệnh héo do virus 14

2.5.1 Lịch sử phát hiện virus PMWaV 14

2.5.2 Tác nhân lây truyền bệnh 16

2.5.3 Triệu chứng 18

2.5.4 Cách phòng trị 19

2.6 Marker liên kết tính kháng bệnh trên thực vật 20

2.6.1 Tính kháng bệnh trên thực vật 20

2.6.1.1 Kháng bệnh đơn gene (monogenic resistance) 21

2.6.1.2 Kháng bệnh đa gene (polygenic resistance) hay QTL kháng 21

2.6.2 Xác định marker phân tử liên kết gen kháng bệnh ở thực vật 21

2.6.3 Một số nghiên cứu phát hiện marker phân tử cho tính kháng bệnh trên thực vật bằng kỹ thuật RAPD 22

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp Hồ Chí Minh 23

3.1.1 Thời gian và địa điểm 23

viii

3.1.5.2 Tối ưu hoá phản ứng RAPD 26

3.1.5.3 Thực hiện phản ứng RAPD 28

3.1.5.4 Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot 28

3.2 Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne 30

3.2.1 Thời gian và địa điểm 30

3.2.2 Đối tượng 30

3.2.3 Dụng cụ 30

3.2.4 Phương pháp tiến hành 31

3.2.4.1 Nuôi rệp 31

3.2.4.2 Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh 31

3.2.4.3 Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh 32

3.3 Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne 33

3.3.1 Thời gian và địa điểm 33

3.3.2 Đối tượng 33

3.3.3 Dụng cụ và thiết bị 33

3.3.4 Hóa chất 33

3.3.5 Phương pháp 33

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Đánh giá đa dạng di truyền của cây dứa Cayenne bằng kỹ thuật RAPD 35

4.1.1 Kết quả ly trích DNA tổng số từ lá dứa 35

4.1.2 Tối ưu hoá phản ứng RAPD 35

4.1.3 Thực hiện phản ứng RAPD 36

4.1.4 Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot 40

4.2 Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne 43

4.2.1 Nuôi rệp 43

4.2.2 Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh 45

4.2.3 Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh 46 4.3 Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo

OUT Operational Taxonomic Unit PCR Polymerase Chain Reaction

PMWaV Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus QTL Quantivative Trait Locus

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TAE Tris – Acetate – EDTA

Tm Melting temperature

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2.1 Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD 10

Hình 2.2 Rệp sáp hồng (Dysmicoccus brevipes) và rệp sáp xám (D neobrepes) 16

Hình 2.3 Cây dứa bệnh và không bệnh héo đỏ đầu lá 18

Hình 2.4 Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá 19

Hình 2.5 Bọ rùa Cryptolaemus montrouzieri 20

Hình 2.6 Ong bắp cày Anagyrus ananatis 20

Hình 3.1 Thả rệp lên bí 31

Hình 3.2 Dứa bệnh làm nguồn lây PMWaV 32

Hình 3.3 Vị trí thả rệp lên dứa sạch bệnh 33

Hình 4.1 Kết quả ly trích DNA dứa 35

Hình 4.2 Kết quả khảo sát nồng độ Taq polymerase 36

Hình 4.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer 36

Hình 4.4 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAC10 38

Hình 4.5 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAH13 38

Hình 4.6 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB01 39

Hình 4.7 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB08 39

Hình 4.8 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer S1384 40

Hình 4.9 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer V20 40

Hình 4.10 Cây phân nhóm di truyền dựa vào kết quả RAPD 41

Hình 4.11 Độ tin cậy của các phân nhóm 42

Hình 4.12 Các kiểu phân nhóm khác 43

Hình 4.13 Rệp phát triển trên bí sau 1 tháng 44

Hình 4.14 Chuyển Rệp bằng đèn 45

Hình 4.15 Rệp phát triển trên dứa bệnh 1 tuần sau khi chủng 46

Hình 4.16 Rệp bám vào mặt sau lá dứa bệnh 46

Hình 4.17 Rệp phát triển trên dứa sau khi chủng 47

xii

Hình 4.18 Dứa biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá 48 Hình 4.19 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPAC10 49 Hình 4.20 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPB08 49 Biểu Đồ 4.1 Sự phát triển của rệp ở 25-26oC và 33-34oC (nhiệt độ phòng) 44

xiii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Sản lượng dứa của 5 quốc gia trồng nhiều nhất 4

Bảng 2.2 Quả tươi xuất khẩu 5

Bảng 2.3 Quả tươi nhập khẩu 5

Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong tối ưu hoá nồng độ Taq polymerase 27

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng RAPD 27

Bảng 3.3 Các nghiệm thức trong tối ưu hoá nồng độ primer 28

Bảng 4.1 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa và lan 37 Bảng 4.2 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa Cayenne và dứa Queen 37 Bảng 4.3 Hệ số đồng dạng di truyền của 3 giống dứa Cayenne và các đối chứng 41

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cây dứa (Ananas comosus) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất được ưa chuộng

trên thế giới bởi hương vị đặc trưng và giàu dinh dưỡng (vitamin, acid hữu cơ…) Trong các giống dứa chính, dứa Cayenne mang nhiều đặc điểm của công nghệ chế biến đồ hộp nên đang được trồng rất phổ biến trên thế giới Hiện nay, cây dứa nói chung và dứa Cayenne nói riêng đang nằm trong chương trình cung cấp giống cây chất lượng cao của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành phố Hồ Chí Minh Để phát triển tốt hơn nữa ngành dứa ở vùng này thì điều trước tiên là phải đánh giá đa dạng di truyền nguồn dứa để phục vụ công tác chọn giống và lai giống

Bên cạnh đó, cây dứa Cayenne có nhược điểm chính là có nhiều sâu bệnh phá

hại, đặc biệt là bệnh wilt – héo đỏ đầu lá Bệnh này do virus “Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus” (PMWaV) gây ra Bệnh làm cây dứa tăng trưởng kém, trái

teo nhỏ, không thành thương phẩm Bệnh cũng gây tác hại lên hệ thống rễ và làm vàng lá, gây suy thoái toàn bộ cây Điều đáng quan ngại là, nhiều cây mang mầm bệnh ẩn nhưng bên ngoài vẫn phát triển bình thường gây khó khăn cho việc kiểm soát bệnh đặc biệt là khâu giống Về lâu dài, để chống lại bệnh này chỉ còn cách dùng công nghệ sinh học để tạo ra các giống dứa có tính kháng bệnh

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính

kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phương

pháp RAPD ” được thực hiện với hy vọng là cơ sở để thực hiện có hiệu quả việc lai tạo giống đồng thời tạo cơ sở cho việc chọn ra giống dứa có khả năng kháng tự nhiên đối với bệnh héo đỏ đầu lá, góp phần bảo vệ năng suất, phẩm chất của cây dứa, mang lại hiệu quả kinh tế cho nông dân và xã hội

1.2 Mục tiêu, nội dung và yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu

Phân tích đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng tại Tp Hồ Chí Minh

Xác đinh marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne

Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa

Thực hiện PCR với mồi RAPD để xác định band đa hình liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá dứa

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây dứa [8]

2.1.1 Phân loại và nguồn gốc

Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc: Phân lớp: Magnoliophyta

Lớp: Liliopsida Bộ: Poales

Họ: Bromeliaceae Giống: Ananas Loài: Anana comosus

Dứa có nguồn gốc ở Nam mỹ (Brazil, Achentina, Paragoay ) Hiện nay trên thế giới, cây dứa được trồng ở hầu hết các nước nhiệt đới và một số nước á nhiệt đới có mùa đông tương đối ẩm Dứa được coi là một trong những cây ăn quả nhiệt

đới hàng đầu, loại quả “vua” rất được ưa chuộng ở các nước phương Tây 2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa

2.1.2.1 Việt Nam

Ở nước ta, dứa được trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước hiện khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An…; miền Bắc là Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Quang, Phú Thọ…; miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam, Bình Định… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc khoảng 10 tấn/ha, phía Nam khoảng 15 tấn/ha

Trong năm cây dứa ra hoa nhiều vụ Ở miền Bắc vụ chính ra hoa tháng 2-3, thu hoạch tháng 6-7, vụ trái ra hoa tháng 6-8, thu hoạch tháng 10-12 Ở miền Nam, dứa có thể ra hoa quanh năm, song thường tập trung vào tháng 4-5 và tháng 9-10 Từ khi ra hoa đến thu hoạch trung bình khoảng 4-5 tháng

Ngoài ăn tươi, quả dứa còn dùng chế biến thành dứa hộp và nước dứa, là những mặt hàng xuất khẩu lớn Xác bã quả dứa sau khi chế biến dùng làm thức ăn gia súc và phân bón Thân lá dứa làm bột giấy

2.1.2.2 Thế giới [18]

Sản lượng dứa hằng năm của thế giới tăng gấp 3 trong suốt 40 năm từ 3.833.137 tấn năm 1961 đến 13.738.735 tấn năm 2001 (d’Eeckenbrugge và Leal, 2001) và hiện nay đã vượt quá 13 tỉ tấn (FAOSTAT, 2001) 5 quốc gia sản xuất dứa lớn nhất (bảng 2.1) chiếm khoảng 56% sản lượng của thế giới Sản lượng của Brazil, Columbia và Trung Quốc tăng gấp 3 từ 1980, trong khi Philippines và Indonesia tăng nhẹ (Rieger, 2001)

Bảng 2.1 Sản lượng dứa của 5 quốc gia trồng nhiều nhất

Bảng 2.2 Quả tươi xuất khẩu

Quốc gia Xuất khẩu trong năm 1999 (Tấn)

Bảng 2.3 Quả tươi nhập khẩu

Quốc gia Nhập khẩu trong năm 1999 (Tấn)

Là loại được trồng chủ yếu ở nước ta hiện nay

Đặc tính đóng hộp kém, nhưng dùng để ăn tươi và xuất khẩu tươi rất tốt

Các đặc điểm về hình thái:

Lá: Đầy gai, lá ngắn hơn Cayenne Chồi: Nhiều chồi cuống, chồi nhỏ Dạng quả: Hình nón, mắt sâu Trọng lượng quả trung bình 1 kg Lõi nhỏ

Màu vỏ trái khi chín: Vàng Màu ruột khi chín: Vàng

Hương vị: Ngọt hơn Cayenne, ít chua, ít xơ, xơ ngắn, thơm Thích hợp cho tiêu thụ tươi

Tính đề kháng: Mẫn cảm với bệnh héo đỏ đầu lá Năng suất kém

2.1.3.2 Nhóm Tây Ban Nha

Loại dứa này cũng có đặc tính đóng hộp kém, nhưng dùng để ăn tươi và xuất khẩu tươi rất tốt

Các đặc điểm về hình thái: Lá: Dài, hẹp, có gai

Dạng quả: Hơi tròn, mắt rộng, dẹp

Trọng lượng quả trung bình từ 1,2-1,5 kg Lõi rất lớn

Màu vỏ trái khi chín: Cam

Màu ruột khi chín: Trắng đến vàng

Hương vị: Ngọt, hơi có vị cay chua, nhiều xơ Tính đề kháng: Kháng bệnh héo đỏ đầu lá Năng suất kém

2.1.3.3 Nhóm Cayenne

Là loại được trồng rất phổ biến trên thế giới, đồng thời cũng được dùng để đóng hộp nhiều nhất

Các đặc điểm về hình thái:

Lá: Gần như không có gai, chỉ có một ít gai ở chóp lá Chồi: Ít chồi

Dạng quả: Hình trụ, mắt dẹp, cạn Trọng lượng quả trung bình từ 2-2,5 kg Lõi (cùi dứa) trung bình

Màu vỏ trái khi chín: Vàng da cam Màu ruột khi chín: Vàng nhạt đến vàng

Hương vị: Ngọt, hơi chua, ít xơ, nhiều nước, mềm Tính đề kháng: Mẫn cảm với bệnh héo đỏ đầu lá Năng suất cao

Dứa Cayenne chứa rất nhiều nước, vỏ lại mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển đi xa Tuy nhiên, nước lại có tỉ lệ đường cao, vị chua nhẹ (acid trong dứa Cayenne thấp hơn dứa Queen), mùi thanh, rất hợp khẩu vị người phương Tây Mắt dứa Cayenne lại rất cạn, gọt vỏ xong không cần lấy mắt có thể ăn ngay Những ưu điểm trên rất thuận lợi cho việc chế biến, đóng hộp qui mô công nghiệp nên dứa Cayenne là nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp chế biến - xuất khẩu dứa và hầu như toàn bộ diện tích dứa Cayenne ở nước ta hiện nay đều là vùng nguyên liệu của các nhà máy chế biến dứa

Các giống Cayenne được trồng phổ biến hiện nay là giống Cayenne Thái Lan, Cayenne Trung Quốc và Cayenne Lâm Đồng Theo tài liệu của Viện cây ăn quả miền Nam, giống Cayenne Thái Lan và Trung Quốc đều cho trái to và phát triển tốt; tuy nhiên là giống mới nhập nội nên cần có thời gian để kết luận Giống Cayenne Lâm Đồng đã phát triển lâu đời ở Việt Nam , thích nghi với khí hậu nước ta , phẩm chất tốt nên phát triển trong giai đoạn hiện nay

2.2 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị 2.2.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị

Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của

một loại đột biến nào đó Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống Sự khác biệt về di truyền như vậy được gọi là tính đa dạng di truyền (trích dẫn bởi Lê Văn Huy, 2005) [5]

Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra được sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị

Có 3 loại chỉ thị thường được sử dụng: Chỉ thị hình thái

Chỉ thị isozyme Chỉ thị phân tử

2.2.2 Chỉ thị hình thái

Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể phát hiện được Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lượng chỉ thị ít do không phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện được, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp

2.2.3 Chỉ thị isozyme

Isozyme là các dạng khác nhau của 1 enzyme của một cá thể, có cùng chức năng xúc tác cho một phản ứng (hoạt tính xúc tác tương tự hoặc giống nhau) nhưng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau Nói cách khác, isozyme là tất cả các dạng khác nhau của một enzyme được mã hoá bởi một locus di truyền Hoạt tính của chúng đặc trưng đối với một cơ chất và trợ chất enzyme nhất định Chỉ thị isozyme là chỉ thị sinh hoá Về di truyền isozyme được chia làm 2 loại:

Isozyme đơn gene: chịu sự kiểm soát của một gene có thể có các kiểu phân tử khác nhau do có sự khác nhau về thành phần và trật tự acid amin và có thể phân tách được bằng điện di

Isozyme đa gene: tạo ra bởi hai hay nhiều gene

Dựa vào đặc tính tích điện âm trên bề mặt, khi chiu tác động của dòng điện một chiều isozyme sẽ di chuyển (trên gel polyacrylamide hoặc gel tinh bột) về cực dương của điện trường

Isozyme được sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt trong nghiên cứu đa dạng di truyền của thực vật và động vật, khoảng cách lan rộng của hạt phấn , định danh giống, kiểm tra phả hệ…

Kết quả mà chỉ thị isozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do số lượng chỉ thị có thể phát hiện được nhiều hơn, tuy nhiên số lượng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng

2.2.4 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA

Là những chỉ thị được tạo ra nhờ phương pháp cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme) hoặc PCR Các chỉ thị phân tử này có thể liên kết với một gene nào đó trong nhiễm sắc thể

Các chỉ thị DNA có nguồn gốc từ hai nhóm:

Chỉ thị dựa vào phương pháp lai DNA: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Chỉ thị dựa vào phương pháp PCR: SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism), STS (Sequence – Tagged Sites), Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), DAF (DNA Amplification Fingerpriting) …

Lợi ích của chỉ thị DNA so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme: Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền

Có rất nhiều chỉ thị DNA trong quần thể

Phân tích không bị ảnh hưởng bởi môi trường và giai đoạn phát triển của đối tượng

2.2.5 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR , bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) Nếu 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau Khi có khác biệt giữa các cá thể thì sẽ có sự thay đổi về số lượng và vị trí bắt cặp ngẫu nhiên nên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể

Hình 2.1 Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD

Ghi chú: - Các mũi tên biểu thị cho các vị trí gắn của primer trên mạch đơn DNA mẫu Trong trường hợp này, có 2 sản phẩm PCR được tạo thành:

Sản phẩm A: là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2 và 5

cứu đa dạng di truyền một số cây trồng một và hai lá mầm như lúa, chuối, dứa, bông cải, cà chua, dừa, cacao, điều… Ngoài ra RAPD còn dùng để phát hiện đột biến , phát hiện chỉ thị phân tử, xây dựng bảng đồ gene

Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện, thao tác đơn giản, chi phí thấp, không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng, chất lượng DNA tổng số không đòi hỏi quá tinh sạch, cho đa hình cao và thời gian thực

hiện ngắn

Những hạn chế của kỹ thuật RAPD: Kỹ thuật RAPD không ổn định (độ lặp lại thấp), cho đa hình cao nhưng độ tin cậy lại thấp

2.3 Các phương pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài [3]

Tất cả các phương pháp nghiên cứu sự đa dạng của quần thể đều cho kết qủa cuối cùng là các dữ liệu phân tử phức tạp như các băng vạch trên bảng điện di hoặc thông tin trình tự DNA, RNA, protein Để lấy được các thông tin sinh học từ dữ liệu thô này, các nhà khoa học cần đến sự hỗ trợ của máy tính với các phần mềm phân tích dữ liệu thực nghiệm Các thông số về độ đa dạng kiểu gene, độ đa dạng kiểu hình, khoảng cách gene giữa các cá thể được tính toán theo phương trình của Dice (1979) Từ các thông tin này, cây phát sinh loài sẽ được xây dựng khi dùng các phương pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic), Neighbor Joining, Transformed distance, Neighbors-relation, Maximum parsimoni hoặc Maximum likehood, Minimum evolution Trong các phương pháp trên thì phương pháp UPGMA là phương pháp đơn giản nhất và đang được sử dụng phổ biến nhất

UPGMA phản ánh mức tương tự kiểu hình giữa các OTU (Operational Taxonomic Unit) (đại diện cho các cá thể ) với các bước sau: Trước tiên tạo ma trận tương quan giữa các OTU từ dữ liệu đa hình; với ma trận trên, thuật toán sẽ nhóm một cặp OTU có khoảng cách nhỏ nhất (có mức tương đồng gene cao nhất) với giá trị bằng nửa khoảng cách giữa hai OTU; sau đó, cặp đơn vị tiến hóa này được xem như một OTU mới và khoảng cách giữa OTU mới này với một OTU khác là trung bình khoảng cách giữa OTU đó với OTU còn lại trong nhóm Thuật toán tiếp tục

nhóm các OTU có khoảng cách nhỏ nhất cho đến khi chỉ còn có hai OTU Sau cù ng là tạo một cây tiến hóa có gốc

Để đánh giá độ chính xác của cây phân loài thì phương pháp thông dụng nhất là dựng bootstrap Nguyên tắc của phương pháp này là thay đổi các thông số của ma trận khoảng cách để tạo ra nhiều ma trận khoảng cách khác có cùng kích thước với ma trận gốc Mỗi một ma trận tạo ra sẽ lập thành một cây phát sinh loài Độ tin cậy của 1 phân nhóm được đánh giá dựa vào mức độ lập lại của phân nhóm đó

2.4 Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền dứa trên Thế Giới và Việt Nam [4]

2.4.1 Nghiên cứu trên Thế Giới

Hiện nay, nhu cầu sản lượng dứa trên thế giới dùng cho chế biến ngày càng tăng đòi hỏi các nhà chọn giống phải tạo ra những giống có chất lượng phù hợp với nhu cầu thị trường Vì thế, nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên dứa đã được thực hiện và thành công với sự đóng góp của các loại marker (chỉ thị) phân tử nhằm cung cấp những thông tin về di truyền để chọn giống chính xác hơn Những thành công được thể hiện qua những nghiên cứu sau:

Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y Kato và

ctv, 1992) Sự đa dạng di truyền được tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus L) và 3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas erctifolius) Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A comonus và A ananassoidies với mức tương quan của A comonus (0,398) và A.ananassoidies

(0,381) Qua đó cho thấy sự khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có thể do đột biến

Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv,

2001) đã cho thấy được sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas comosus là 58,7% qua sử dụng 18 probe tương đồng để lai

Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống

(dòng) dứa được thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của chúng Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác

biệt với các loài hoang dại Sự khác biệt này do tự bản thân giống hoặc do yếu tố môi trường, tỷ lệ đột biến và sự khác biệt dòng soma

Xác định độ tin cậy kiểu gene của cây dứa vi nhân giống liên quan đến marker isozyme và RAPD (Sergio Feuse và ctv, 2003)

Đánh giá sự liên quan di truyền của giống dứa Ananas và Pseudananas bằng

marker RAPD (Claudete de Fátima Ruas1và ctv, 2001)

2.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta, hiện nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gene bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như RAPD, AFLP, SSR… Tuy số lượng của các nghiên cứu này chưa nhiều nhưng đã cho thấy chúng ta có khả năng thực hiện những nghiên cứu sử dụng công nghệ tiên tiến nhằm đẩy mạnh công tác chọn tạo giống, vật nuôi, cây trồng Dưới đây là một số nghiên cứu đã ứng dụng thành công trên dứa như:

Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng phương pháp RAPD (Hoàng Thị Bích Thuỷ và Bùi Văn Lệ, 2004) Kết quả nghiên cứu này đã phân nhóm được 7 giống (dòng) qua sử dụng 9 loại primer đã xác định được các quần thể Trung Quốc 220 và Trung Quốc 250; Đắc Lắc và Thái Lan có cùng nguồn gốc và quần thể dứa Lâm Đồng và Đắc Lắc; Lâm Đồng và Thái Lan là các quần thể xa nhau về mặt nguồn gốc

“Nghiên cứu đa dạng nguồn gene dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử” (Lê Thị Thanh Tuyền và Nguyễn Thị Lang, 2004) 13 primer RAPD (10 nucleotide) được sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của 50 dòng dứa Cayenne ở đồng bằng Sông Cửu Long (Long Định và viện lúa ĐBSCL) Bên cạnh phân tích bằng sinh học phân tử đề tài còn tiến hành đánh giá đa dạng nguồn gene dựa vào dữ liệu kiểu hình với các chỉ tiêu sau: Chiều cao cây, chiều rộng cây, chiều dài lá, chiều rộng lá, số lá, ngày trổ hoa, trọng lượng trái, hình dạng lá có gai, không gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở một số vị trí trên lá như ngọn, gốc hoặc giữa lá) và màu sắc lá Kết quả: Phân nhóm di truyền của 50 giống Cayenne dựa trên dữ liệu sản phẩm PCR - RAPD phân thành 3 nhóm chính, với khoảng cách

phân nhóm là 0,66 Nhóm I gồm 20 dòng dứa, nhóm II gồm 3 dòng và nhóm III là 27 dòng, trong mỗi nhóm đều chứa những dòng dứa có nguồn gốc nhập ngoại và nhập nội Sự tương đồng về di truyền giữa nhóm I hoặc nhóm II với nhóm III là 49 % và nhóm I với nhóm II là 63%; trong cùng một nhóm thì nhóm III có mức tương đồng về di truyền cao nhất 71% Khoảng cách di truyền giữa 50 dòng dứa Cayenne qua phân nhóm dao động từ 0,27 – 1,0 với những dòng dứa được trồng từ dạng nuôi cấy mô có sự tương đồng về di truyền cao nhất

Bên cạnh đồng bằng Sông Cửu Long, nơi cung cấp dứa có chất lượng thì Tp Hồ Chí Minh cũng là vùng dứa lớn Để phát triển tốt hơn ngành dứa ở vùng này thì điều trước tiên là phải đánh giá về đa dạng di truyền nguồn dứa để phục vụ công tác chọn giống và lai giống

2.5 Bệnh héo do virus [1]

Bệnh héo đỏ đầu lá hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới Theo Sether D.M và Hu J.S (2002), bệnh đã xuất hiện ở Mỹ, Đài Loan, Singapore, Brazil, Jamaica, Philippines, Venezuela, Thái lan, Malaysia và cả ở Việt Nam

Đây là bệnh rất nguy hiểm và ảnh hưởng lớn đến nghề trồng dứa Không như các bệnh khác trên dứa do vi khuẩn, nấm hay tuyến trùng đều có các loại thuốc phòng trị đặc hiệu, bệnh héo đỏ đầu lá cho đến nay vẫn chưa có biện pháp phòng trừ triệt để ngoài việc hạn chế sự lây lan là diệt môi giới truyền bệnh (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2001)

Bệnh do virus PMWaV gây ra Virus được bảo tồn và lan truyền sang đời sau chủ yếu qua chồi giống và tàn dư của cây bệnh Những chồi giống mang mầm bệnh lại thường chỉ biểu hiện triệu chứng vào giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa trở đi, tức là sau một thời gian trồng rất dài (9 - 12 tháng) Chính đặc điểm này của bệnh héo đỏ đầu lá đã gây nên những thiệt hại kinh tế to lớn cho người trồng dứa (Borroto E.G và cs, 1998)

2.5.1 Lịch sử phát hiện virus PMWaV [14] [12] [16] [17]

Trong những năm 1920, người trồng dứa ở Hawaii nhận thấy có nhiều kiến trong các vùng trồng dứa bị bệnh Họ cho rằng kiến là nguyên nhân gây bệnh và tìm cách tiêu diệt kiến để bảo vệ vườn dứa

Illingworth (1931) đã chứng minh rằng kiến không phải là nguyên nhân gây bệnh mà rệp sáp mới là nguyên nhân gây bệnh Carter (1939) báo cáo rằng nước bọt của rệp sáp gây độc cho dứa dựa trên các quan sát sau : Bệnh xảy ra khi có 1 lượng lớn rệp hiện diện trên dứa; có mối quan hệ bằng thực nghiệm giữa số lượng rệp, thời gian rệp tồn tại trên dứa với cừơng độ bệnh; cây phục hồi khi rệp bị diệt Carter và Schmidt (1935) thực hiện thí nghiệm xác định số lượng rệp tối thiểu để gây bệnh héo đỏ đầu lá Tuy nhiên tỉ lệ mắc bệnh lại không khác biệt có ý nghĩa giữa lô chỉ thả 1 rệp với lô đối chứng không có rệp, do lô chỉ thả 1 rệp chỉ có vài cây biểu hiện bệnh Carter kết luận 1 rệp cũng có thể gậy bệnh và bệnh có thời gian ủ bệnh có thể tới 2 tháng

Gunasinghe và German (1989), Maramorosch và cộng sự (1984), Ullman và cộng sự (1989) đã phân lập được 1 loại closterovirus hình que trên các cây dứa có

và không có triệu chứng bệnh và gọi là Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus

(PMWaV) Hu và cộng sự (1996) phát hiện PMWaV trên rệp thu từ các cây dứa bệnh mà không phát hiện PMWaV trên rệp thu từ bí đỏ Các nghiên cứu này đã chứng minh được PMWaV là nguyên nhân chính gậy ra bệnh héo đỏ đầu là trên dứa

Melzer và cộng sự (2001) đã phát hiện có ít nhất 2 loại PMWaV (PMWaV-1, PMWaV-2) gây bệnh trên dứa Sether và Hu (2002) chứng minh rằng bệnh chỉ biểu hiện triệu chứng khi có sự xâm nhiễm của rệp sáp và virus PMWaV-2, bệnh không biểu hiện triệu chứng khi không có rệp hoặc cây có rệp mà chỉ nhiễm PMWaV-1 Sether, Hu, Melzer, Busto và Zee (2004) thực hiện RT-PCR với primer thoái hóa cho protein HSP-70 đã phát hiện thêm 2 loại PMWaV là PMWaV-3 và PMWaV-4 Như vậy cho đến nay đã phát hiện được 4 loại PMWaV trên dứa có biểu hiện triệu

chứng bệnh nhưng chỉ có PMWaV-2 gây biểu hiện triệu chứng theo nghiên cứu của Sether và Hu (2002)

2.5.2 Tác nhân lây truyền bệnh [1] [19] [20]

PMWaV-1 và PMWaV-2 được truyền bởi 2 loại rệp sáp: Dysmicoccus brevipes (rệp màu hồng) và D neobrepes (rệp màu xám) (Sether và Hu, 1997;

Sether và cộng sự, 1998)

Hình 2.2 Rệp sáp hồng (Dysmicoccus brevipes) và rệp sáp xám (D neobrepes)

(Nguồn: http://www.bromeliadbiota.ifas.ufl.edu)

Rệp sáp D neobrevipes sinh sản hửu tính Không đẻ trứng, trứng nở trong cơ

thể con mẹ và ấu trùng chui ra từ con mẹ gọi là crawler Giai đoạn crawler là giai đoạn phát tán chính Crawler di chuyển trong khoảng thời gian ngắn không quá 1 ngày và có thể di chuyển hàng trăm mét nhờ gió Con cái trải qua 3 lần lột xác trước khi thành thục Các giai đoạn ấu trùng của con cái kéo dài 11–23 ngày, 6–20 ngày và 7–28 ngày theo thứ tự Tổng thời kì ấu trùng của con cái khoảng 26–52 ngày Trong thời kỳ ấu trùng rệp chỉ ăn trong giai đoạn 1 và 2 Khi con cái trưởng thành có 1 khoảng thời gian 25 ngày trước khi nó sinh lứa con đầu tiên Trong khoảng thời gian này con cái giao phối với con đực Con cái sau đó sinh trong khoảng 30 ngày và chết sau 4 ngày ngừng sinh sản Mỗi con cái có thể sinh 350 con nhưng có thể lên tới 1000 con Con cái không được giao phối sống trung bình 148 ngày, trong khi con cái được giao phối sống trung bình 95 ngày

Con đực lột xác 4 lần trước khi mọc cánh (trưởng thành); mỗi giai đoạn ấu trùng kéo dài 11–19 ngày, 7–19 ngày, 2–7 ngày và 2–8 ngày theo thứ tự Tổng thời

gian giai đoạn ấu trùng là 22–53 ngày Con đực chỉ ăn trong giai đoạn 1 và 2 Các lần lột xác xảy ra trong kén sáp trong khoảng thời gian là 12 ngày Khi ra khỏi kén thì con đực trưởng thành chỉ dài 1 mm với 1 đôi cánh màng và không có vòi chích hút (mouthparts) Con đực trưởng thành sống được khoảng 3-7 ngày Con đực có vòng đời khoảng 59–117 ngày

Rệp sáp Dysmicoccus brevipes có các đặc điểm sinh học tương tự như rệp sáp Dysmicoccus neobrevipes: Giai đoạn ấu trùng của con cái trải qua 3 giai đoạn lần

lượt là 10; 6,7 và 7,9 ngày Giai đoạn ấu trùng của con đực gồm 4 giai đoạn 9,9; 5,8; 2,5 và 3,7 ngày Giai đoạn từ ấu trùng đến thành trùng khoảng 24 ngày (cả đực và cái) Thành trùng cái sống trong khoảng từ 17- 49 ngày, trong khi đó thành trùng đực chỉ sống được 1-3 ngày Thành trùng cái đẻ từ 19-137 con, trong tự nhiên tỷ lệ

đực cái là 1:1 Rệp sáp D brevipes Có 2 kiểu sinh sản: Đơn tính và lưỡng tính Kiểu

sinh sản đơn tính tìm thấy ở Hawaii, ở đây chỉ có con cái được sinh ra và không cần con đực thụ tinh Còn ở Brazil có cả 2 dạng sinh sản đơn tính và lưỡng tính

Ở nước ta Rệp xuất hiện nhiều vào các tháng có ẩm độ không khí 70-80%, nhiệt độ thấp 15-20oC Rệp tập trung ở gốc dứa, phần ngầm dưới đất và sát trên mặt đất Vào tháng 5-9 rệp thường bò trên lá, quả, chồi ở trên cao Rệp sáp bám vào các lá non, vào gốc lá già, vào mắt quả, vào rễ cây để hút dịch cây làm cây sinh trưởng kém, lá vàng và khô Trong khi chích hút nhựa chúng thải ra chất đường mật hấp dẫn kiến và nấm bồ hóng làm cho cây kém phát triển trầm trọng Khi cây dứa suy kiệt (gần hết nhựa) thì kiến lại tha rệp đến cây khác Ngoài ra Kiến còn ăn một số động vật là kẻ thù tự nhiên của rệp nên có thể xem rệp và kiến có sự cộng sinh với nhau Rệp thực chất không chứa virus, chúng sống trên cây dứa nhiễm PMWaV và thu được virus Rệp tiếp thu và truyền virus trong suốt quá trình dinh dưỡng Không có ký chủ khác của virus được tìm thấy ngoài cây dứa mặc dù nhiều loài cỏ cũng là ký chủ của 2 loại rệp này Điều đó cho thấy cây dứa nhiễm PMWaV là nguồn chứa virus duy nhất cho rệp truyền sang cây khác

Hình 2.3 Cây dứa bệnh và không bệnh héo đỏ đầu lá

a: Dứa không bệnh; b: dứa bệnh

Bệnh héo đỏ đầu lá thường trải qua 4 giai đoạn phát triển: Xâm nhiễm: Biểu hiện bệnh là chóp lá có màu đỏ

Lây lan: Lá chuyển từ màu đỏ sang hồng, mép phiến lá uốn cong về phía mặt dưới

Héo lá: Các lá bị bệnh khô dần, lá ở nõn vẫn mọc bình thường Gây chết cây

Hình 2.4 Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá

Trong chu kì của thực vật, giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa và sau đó một chút là lúc cây dễ nhiễm bệnh nhất Hậu quả là quả bị nhỏ, chua, khô, mắt lộ rõ,

không có giá trị thương phẩm (Trần Thế Tục - Vũ Mạnh Hải, 2001) 2.5.4 Cách phòng trị [1] [20]

Để phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá, theo Nguyễn Văn Kế (2000), cần áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp như:

Chọn giống kháng bệnh Lấy giống từ vùng ít bệnh

Xử lý vật liệu trồng bằng thuốc trừ rệp sáp

Trước khi trồng, khử đất để trừ kiến và các ổ rệp Vệ sinh đồng ruộng để khỏi lây lan vụ sau

Trong quá trình dứa phát triển cần theo dõi phun thuốc trừ rệp, kiến Hiện nay trên thế giới biện pháp sinh học đã được áp dụng khá phổ biến và tỏ ra hữu hiệu để phòng trị rệp sáp trên dứa Các loài thiên địch sau đây đã được du

nhập và Hawaii để phòng trị rệp sáp: Các loài kí sinh bao gồm Aenasius cariocus

Compere, Aenasius colombiensis Compere, Anagyrus ananatis Gahan,

Euryhopauus propinquus Kerrich, Hambletonia pseudococcina Compere và Ptomastidae abnormis (Girault) Động vật ăn thịt bao gồm Cryptolaemus montrouzieri Mulsant, Lobodiplosis pseudococci Felt, Nephus bilucernarius Mulsant, Scymnus (Pullus) unicatus Sicard và Scymnus pictus Gorham Tuy nhiên

các loài này sẽ không hiệu quả nếu có sự hiện diện của kiến công sinh

Hình 2.5 Bọ rùa Cryptolaemus montrouzieri [10]

a: Ấu trùng; b: Bọ rùa trưởng thành

Hình 2.6 Ong bắp cày Anagyrus ananatis [10]

2.6 Marker liên kết tính kháng bệnh trên thực vật 2.6.1 Tính kháng bệnh trên thực vật [2]

Cây thể hiện tính kháng đối với ký sinh gây bệnh là do chúng mang các đặc tính phân loại khác với nhóm ký chủ của ký sinh gây bệnh, hoặc là cây chứa các gene kháng mà ký sinh không có gene tương ứng để phá vỡ Hiện tượng từ kháng trở thành nhiễm của cây trồng đối với vi sinh vật gây bệnh là do số lượng khác nhau của gene kháng hiện diện ở mỗi giống và ảnh hưởng của gene kháng đối với ký

sinh Trường hợp giống nhiễm nặng đối với vi sinh vật gây bệnh là do không có gene kháng một cách hiệu quả chống lại nòi gây bệnh đó Như vậy, sự kháng bệnh của cây trồng là do gene điều khiển Một số giống cây trồng có thể có tính kháng đơn gene hoặc đa gene tuỳ theo số gene đối kháng với một đối tượng bệnh cây mà nó có

resistance)

Tính kháng bệnh đơn gene thường do một gene có tính trội điều khiển hoặc có thể do một vài gene điều khiển nhưng các gene này định vị rất gần nhau và liên kết với nhau rất chặt chẽ Các gene kháng này có tính chuyên biệt cao đối với một dòng sinh lý của mầm bệnh Do đó các giống có tính kháng đơn gene thường kháng rất mạnh đối với dòng sinh lý của mầm bệnh tương ứng Tuy nhiên, khi gặp dòng sinh lý khác của mầm bệnh, các giống này trở thành nhiễm bệnh và nhiễm nặng Sử dụng thường xuyên giống kháng đơn gene rất dễ dẫn đến sự chuyển đổi dòng sinh lý mới của mầm bệnh và tấn công được giống này

1.1.1.2 2.6.1.2 Kháng bệnh đa gene (polygenic resistance) hay QTL kháng

Tính kháng bệnh của nhóm này được biểu hiện bởi nhiều gene Các gene kháng này có thể có gene trội lẫn gene lặn và định vị trên các loci có tính số lượng (QTL) Do có nhiều gene kháng nên các giống trong nhóm này có thể kháng với nhiều dòng sinh lý khác nhau của mầm bệnh Nhờ đó, tính kháng của giống thường bền hơn, lâu bị phá vỡ hơn nhóm giống kháng đơn gene Tuy nhiên, tính kháng của nhóm này thường không mạnh bằng nhóm kháng đơn gene Các giống kháng đa gene thường gây phiền phức cho các nhà lai tạo giống do có nhiều gene kháng và có cả gene lặn nên phân ly rất phức tạp và khó chọn lọc về sau

1.1.2 2.6.2 Xác định marker phân tử liên kết gene kháng bệnh ở thực vật

Hiện nay rất nhiều marker phân tử cho tính kháng bệnh ở thực vật đã được xác định dựa vào phương pháp PCR hay lai phân tử Có marker liên kết với các gene

kháng bệnh chuyên biệt và cũng có marker liên kết với QTL kháng Mặc dù hầu hết những marker gắn với QTL còn cách biệt quá xa với nhau, chưa đủ sức dự đoán chính xác cho một chương trình chọn lọc giống hiệu quả nhưng các marker phân tử này cũng đã đóng góp to lớn trong việc chọn lọc các giống cây trồng có khả năng kháng bệnh

2.6.3 Một số nghiên cứu phát hiện marker phân tử cho tính kháng bệnh trên thực vật bằng kỹ thuật RAPD

B Moury và ctv (2000) đã sử dụng 250 primer RAPD phân tích 153 cá thể F2 của tổ hợp lai PI195301(mẩn cảm)xPI152225(kháng bệnh) đã xác định được 4 maker liên kết tính kháng bệnh héo đốm do virus trên tiêu (OPAC10-593bp, OPAH13-800bp, OPAF16-250bp, OPB01-750bp) [9]

Xác định maker liên kết tính kháng bệnh nấm vảy ở lúa mì (Guihong YU và ctv, 2003) [13]: Dùng 520 primer RAPD phân tích quần thể F7 của tổ hợp lai Ning894037 (kháng)xAlondra (mẩn cảm), Guihong đã xác định được 3 primer S1384, S1360, S1319 khuếch đại 4 band (640bp, 600bp, 350bp, 820bp) liên kết với tính kháng bệnh nầm vảy ở lúa mì

Marker phân tử liên kết gene Vbj kháng bệnh nấm vảy trên táo bắt nguồn từ táo dại Malus baccata jackii (M Gygax và ctv, 2004) [15]: Quần thể 173 cá thể F2 từ tổ hợp lai A722-7× cv Golden Delicious (A×GD) (Giống A722-7 mang gene Vbj kháng

bệnh mấm vảy, còn giống Golden Delicious là giống mẩn cảm) được chọn ra 10 cây kháng và 10 cây bê ̣nh Dùng 506 primer RAPD (10 nucleotide) để thực hiê ̣n phản ứng PCR cho 20 cây này M.Gygax và ctv đã xác định được 3 primer RAPD là: OPB08, OPK08, OP123 khuếch đại các band 710bp, 848bp, 869bp có hiện diện trong nhóm

kháng và mẹ A722-7(có gene Vbj) nhưng không hiện diện trong nhóm mẩn cảm và bố GD Phân tích 173 cây con F2 của AxGD thì thấy 3 marker đã liên kết với gene Vbj có

tần số liên kết là 16,2% - 22%

Các nghiên cứu trong nước chỉ dừng lại ở việc sử dụng các marker phân tử có sẵn để chọn giống Tuy nhiên trong các nghiên cứu này thường không dùng marker RAPD mà dùng các marker như SSR, RFLP, STS do marker RAPD không ổn định Marker RAPD chỉ được ứng dụng trong nghiên cứu xác định các loại marker khác thông qua bảng đồ di truyền