Chọn những cây dứa khỏe. Lấy khoảng 3-4 lá non, không lấy lá già, cắt bỏ phần ngọn, lau sạch rồi cho vào túi nilon đã ghi đầy đủ thông tin về mẫu và giữ mát trong thùng đá. Sau đó mẫu đƣợc đem giữ ở tủ –20oC tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Thực hiện ly trích theo quy trình của Dolye có cải tiến (1990).
Nghiền 0,5 g lá trong nitơ lỏng, cho bột mịn vào eppendorf 1,5 ml. Thêm 1 ml dung di ̣ch CTAB đã đƣợc đun nóng ở 650C.
Mẫu đƣơ ̣c ủ trong 1 giờ ở 650C. Ly tâm, chuyển phần dịch qua eppendorf mới.
Sau đó thêm vào 500 μl phenol/chloroform/isoamilalcohol (25:24:1), lắc nhẹ và đều.
Ly tâm trong 15 phút ở 11.000 vòng/phút.
Hút dịch nổi và tủa DNA bằng cách thêm vào isopropanol, để ở 40C trong 15 – 30 phút .
Rửa lại DNA bằng ethanol 700.
Ly tâm và để khô. Sau đó hòa trong dung dịch TE 1X. Bảo quản mẫu ở -200
C.
Đánh giá kết quả bằng điện di
DNA tổng số sau khi ly trích sẽ đƣợc đánh giá định tính bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau khi điện di, gel sẽ đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide trong 10 phút sau đó đƣợc đƣợc chụp bằng máy chụp gel.
Cách tiến hành:
Pha dung dịch TAE 0,5X.
Pha gel agarose với nồng độ 1% (15 ml cho gel 6 và 8 giếng, 30ml cho gel 12 và 17 giếng). Đun bằng lò Viba 2 phút cho agarose tan thật đều.
Để nguội đến 50-550C, đổ vào khuôn, cài lƣợc vào. Chờ 30 phút để agarose đông.
Gở lƣợc ra rồi đặt bảng gel vào buồn điện di.
Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 1 μl loading dye và 4 μl DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA, thời gian 20 phút.
Nhuộm ethidium bromide khoảng 10 phút (có mang bao tay).
Gel sau khi nhuộm sẽ đƣợc chụp bằng tia tử ngoại UV. Nếu mẫu có DNA thì band DNA sẽ phát sáng dƣới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm
nhạt của band điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. Nếu địên di kiểm tra kết quả RAPD thì pha gel 2 % và điện di ở điều kiện 50 V, 400 A trong 60 phút.
Đánh giá kết quả bằng phƣơng pháp đo mật độ quang
Ngƣời ta tính tỉ lệ OD260/OD280 để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid. Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì dung dịch acid nucleic đƣợc xem là sạch. Khi mẫu có lẩn protein hay phenol thì tỉ lệ này sẽ thấp hơn và mẫu DNA không đạt yêu cầu để thực hiện RAPD.
Một cách tổng quát, hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức:
Hàm lƣợng DNA (ng/µl) = [(62,9*OD260)-(36*OD280)] * Độ pha loãng
Phƣơng pháp tính gần đúng hàm lƣợng DNA bằng OD:
Xây dựng đƣờng chuẩn: dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần với dung dịch TE 1X: hút 20 µl dung dịch DNA hòa tan với 1,980 ml TE 1X).
Tiến hành đo OD ở 2 bƣớc sóng OD260, OD280.
Đối với một dung dịch DNA sợi đôi, sự hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm tăng lên khi phân tử DNA bị biến tính tức là khi hai sợi tách rời nhau. Ngƣời ta gọi đó là hiệu quả siêu sắc (hyperchromic effect).
Sau khi đo OD các mẫu DNA tổng số đƣợc pha loãng về nồng độ 50ng/μl để thực hiện phản ứng RAPD. Đây là nồng độ đƣợc cho là tối ƣu cho phản ứng RAPD.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});